発酵法によるdタガトースの製造方法

d-タガトース(d- tagatose)は、6炭素のケトースであるd-ガラクトースの異性体です純粋なd-タガトースは、sterculiのsetigeraの木から分泌されるガムにのみ見られるため、見つけるのは容易ではない。少量のd-タガトースは、低温殺菌牛乳、ホットチョコレート、チーズ、チーズ製品にも見られる。d-タガトースの約20%しか小腸に吸収されないため、基本的にカロリーを生成せず、血糖変動を引き起こさない。一方、d-タガトースは虫歯の形成を防ぐことができ、腸内の微生物が特定のプロバイオティクスの増殖を促進するために使用することもできます[1]。近年、生活水準の向上や肥満、糖尿病などの疾患の拡大に伴い、ショ糖に代わる機能性甘味料としてd-タガトースが求められており、注目されています。

beadleら[2]は、そのためのプロセスを発明した異性体のd-ガラクトースからd-タガトースを生成する1991年(平成3年)4月2日に着工。d-ガラクトースは、ラクトースまたはより安価なホエイ(乳製品製造の廃棄物)を加水分解することによって得られ、プロセスのコストは市場に受け入れられています。しかし、この方法では、反応溶液を中和するために多量の強酸を使用する必要があり、排水汚染の原因となる可能性がある。さらに、反応には多くの副生成物が存在するため、下流の分離が困難である。cheethamら[3]は、l-アラビノースイソメラーゼ(l- ai酵素、ec 5。3. 1. 4)はd-ガラクトースからd-タガトースを合成する触媒を触媒することができる。その後20年の間に、様々な種類の微生物の酵素生産スクリーニング、外生発現および特性評価を通じて、研究者はd-タガトースの工業生産に適した様々なl- ai酵素を発見したl- ai酵素工業生産に適したd-タガトースのl- ai酵素;主にdガラクトースの変換速度が高く、酵素の熱安定性が良好で、酵素の最適触媒phは工業生産に適した酸性条件(ph 5.0 ~ 6.0)であることがわかっている[4]。

一方、分子生物学の方法を用いた野生型l- ai酵素の遺伝子工学は、野生酵素の産業応用の可能性を有効に高めることができる;これは、主にコンピュータ分子シミュレーション技術を用いたl- ai酵素の構造モデルの確立と酵素内の重要なアミノ酸残基の合理的な設計に反映されています。触媒プロセスの面では、固定化された細胞/酵素のバッチ変換技術が成果を上げている;しかし、基質変換速度が低い、反応サイクルが長い、酵素活性半減期が短いなどの課題が残されています。また、組換え大腸菌に代わる安全な食品グレードのl-ai酵素外因性発現宿主の開発が急務となっている。現在、アメリカのスフェリックス社がフェーズ3を実施しています2型糖尿病の治療薬としてのd-タガトースの臨床試験[5]。

裁判が成功すればd-タガトースは、生物医学の分野で広く期待されていますまた、生物学的生産プロセスのためのより緊急の需要を作成します。著者とあわせて研究成果を近年の研究チームのL-AI酵素、生产をbioprocess D-tagatoseの試写会の審議、アプリケーションを提供するためにL-AI酵素遺伝子工学研究られると目的と固定化技术を応用して、グリーン生産方式の参考の提供の新机能甘味料D-tagatoseなど。

1 l- ai酵素の起源と性質に関する研究

現在知られているl-ai酵素は、bacillus subtilis[6]、lactobacillus plantarum[7]、acidothermus thermophilus[8]、geobacillus stearothermophilus[9]、thermus thermophilus[10]などの原核微生物からクローニングや外来発現によって得られている(表1)。

表1に示すように、これらの微生物の生活環境が大きく異なるために、長期にわたる自然進化の結果、異なる供給源からのl-ai酵素の触媒特性も大きく異なる可能性がある。

1) d-ガラクトース異性化反応の最適温度は異なり、15 ~ 95°cと報告されている。その中でも、shewanellのsp. ana-3とlactobacillus sakei 23 kのl-ai酵素は、4°cの低温で安定に触媒することができます[11-12]。長期にわたる自然な進化の後、異なるソースからのl-ai酵素の触媒特性も有意に異なっている。

1) d-ガラクトース異性化反応の最適温度は異なり、15 ~ 95°cと報告されている。

その中でも、shewanella sp. ana-3やlactobacillus sakei 23 kのl-ai酵素は4°cの低温で安定に触媒することができ[11-12]、anoxybacillus flavithermusのl-ai酵素は95°cの極低温でも酵素活性を維持することができる[17]。一般的に、l-ai酵素は、最適な反応温度によって、好中性のl-ai酵素、好熱性のl-ai酵素、好高温性のl-ai酵素の3つに分類される。最適な反応温度はそれぞれ60°c未満、60 ~ 80°c、80 ~ 95°cである[18]。その中でも、d-ガラクトースからの異性化反応に必要なギブス自由エネルギーを主な理由として、熱親和型の方がd-タガトースの工業生産に適していると考えられているd-タガトースは高い(4.96 kj /mol)。高い変換速度を得るためには、比較的高い触媒温度が必要である。しかし、過度に高温になると褐変反応を引き起こし、製品の品質に影響を与えます。そのため、反応温度は60 ~ 70°cが最適と考えられています[1,4]。

2)最適反応phは変化し、5.0から10.5の範囲であると報告されている。ほとんどのL-AI酵素はの最適な触媒pH7.5 8.5間しかし、産業生産には所要費用最適な触媒pH酸性範囲による非特異側反応は自制するアルカリ性反応条件同時に乳糖分解に必要な酸性pH繰り返し調整に対する責任を回避し、簡略化生産プロセス[1、4]の概要を語った。

3)金属イオンの異なる要件。ほとんどのl- ai酵素は、酵素活性を発揮し、熱安定性を維持するために金属イオンを必要とする。その中で、mn2 +イオンとco2 +イオンが最も一般的である。しかし、co2 +は食品産業では使用できないため、co2 +に大きく依存するl-ai酵素は、産業用途としては比較的限られています[10]。興味深いことに、bacillus haloduransおよびbacillus stearothermophilusus100のl- aiの酵素活性はedta治療後も低下しなかった。その理由としては、これら2つの酵素が金属イオンに依存していないか、酵素の活性中心が金属イオンと強い結合能を持ち、金属イオンが離れにくいことが考えられます[16]。

4)基質特異性に有意な差がある。例えば、枯草菌やリケニフォルシスから派生したl- ai酵素は、l-アラビノースを触媒する能力しかなく、l- ai酵素ファミリーの中で非常に特殊なd-ガラクトースを触媒することはできません;l-ai酵素の基質選択性の研究に適しています。

4) d-ガラクトースの触媒効率の違い。l-アラビノースに対するほとんどのl- ai酵素の触媒効率(kcat/ km値)はd-ガラクトースよりもはるかに高いため、l- ai酵素のd-ガラクトースに対する触媒効率は一般的に低い。しかしchengら[15]は、アシドーテルムス細胞分解酵素atcc43068由来のl- ai酵素が、d-ガラクトースに対して比較的高い触媒効率(kcat/ km = 9.3 mmol/(l・min))を有することを見いだした。rhimiら[12]lactobacillus sakei 23 k株からl-ai酵素を得た低温でd-ガラクトースを触媒する酸性の環境でも利用できますd-ガラクトースのkcat/ km値は10.3 mmol/(l・min)に達し、これはこれまでの文献で最も高い値である。

のd-タガトースの工業生産また、d-ガラクトースに対して高い触媒効率を有する好熱性、耐酸性、金属イオン非依存性のl- ai酵素をスクリーニングすることができれば、技術進歩に大きく貢献すると考えられる。私が所属する研究グループは、伝統的な漬物からl-ai酵素を産生するラクトバチルス・フェルメンタム株をスクリーニングしました[19-20]。L-AI酵素符号化遺伝子に含まれるこの株が见つかっexogenously、と组换えL-AI AI酵素同時にD-galactose最適な温度で65°Cと最適なpH、震度6.5触媒としての効率9.02 mmol / (L・ミン)、クラス一定の電位を産業応用[14、21]。

2 l- ai酵素の遺伝子工学

酵素特性の改善の余地があることを考えるl- ai現在、d-タガトースの生産に使用されている酵素これを分子レベルで合理的に修正する努力がなされている。2006年には、大腸菌由来のl- ai酵素の結晶構造が解明され(pdbデータベースのアクセション番号:2 ajt /2 hxg)、その構造生物学的基盤が確立された[22]。近年、l-ai酵素修飾のための有効な手段として、コンピュータホモロジーモデリングによる指向進化技術や部位指向変異誘発法が挙げられる。工業応用の重要な指標として、酵素活性、最適反応温度、最適反応ph、基質選択性の変化が注目されている(表2)。

主要なアミノ酸残基の役割に関する研究は、主にバチルス・ステアロサーモフィルスのl- ai酵素に焦点を当てています。rhimiら[23]は、b . stearothermophilusus100 l- ai酵素の空間構造の分子シミュレーションを行い、175番目のアミノ酸を部位特異的に変異させた。このように、最適反応温度範囲が野生型酵素に比べて広く(50 ~ 65°c)、最適反応温度が高い野生型酵素(80°c)と比較して、生産時の褐変反応回避に有効であることが分かりました。オッら[27]結果site-directedをさらに研究した根拠変異体の408thアミノ酸がg sterothermophilusL-AI酵素の中立を転用アミノ酸極地や的にアミノ酸の最適な反応pH変異株が格段に小さくなり(8.5から7.5%に)。

この推定は、元々中心部このポジションは近くアクティブのL-AI酵素中で着替えの極性の可能性もアミノ酸な変化のmicroenvironmentの分布た電荷を触媒センターの能力が強化さL-AI酵素を使って基板酸性環境ですオッら[28]アミノ酸のベンゼン環164が記録媒体sの側チェーンのサイズアミノ酸475効果を生んでL-AI酵素の手腕を使って大切なことですsite-directed複数のにD-galactoseれアミノ酸gのカスをthermodenitrificans L-AI酵素を作るものです乳糖。その二重変異体c450s-n475kは、d-ガラクトースの触媒効率が5倍向上し、d-ガラクトースの変換率が46%から58%に上昇した。2010年、p rabhuらは相同性モデリングを用いてb . licheniformis l-ai酵素の触媒中心とその周辺のアミノ酸残基を解析し、複数の部位を選択的に変異させた[25]。その結果、y333a変異体はl-アラビノースを触媒する能力を完全に失った。著者は、触媒活性中心の重要なアミノ酸残基と基質との距離が触媒能力を決定すると考えている。したがって、触媒中心付近に保存されたアミノ酸残基は、l-ai酵素の基質特異性にとって重要である。これは、l- ai酵素の基質特異性を変更するためのアイデアを提供する。

3固定化技術を用いたd-タガトースの製造

最も効果的な生物学的生産方法だと考えられていますD-tagatoseこれまでに、d-タガトースを生産するための固定化された細胞/酵素技術が深く研究され、様々な生産プロセスが確立されている(表3)。

3.1固定化細胞技術を用いたd-タガトースの生産

アルギン酸ナトリウムを用いて組換え大腸菌の細胞を固定化する方法produce d-タガトースは、長い間、研究者の視野の分野にありました。この方法は、操作性が高く、信頼性が高く、安価であり、産業応用の可能性がある。一般的には、誘導性発現後、組換え大腸菌細胞にアルギン酸ナトリウムを埋め込み、cacl2で処理した後、d-ガラクトースを触媒することができる。hongらは、アルギン酸ナトリウム固定化組換え大腸菌細胞を用いてd-タガトースを安定的かつ安価に生産する技術を確立した[35]。大腸菌の細胞でd-タガトースを作ります

半減期は43日で、aを生成する高純度(> 99%) D-tagatoseイオン交換カラムで分離された後。しかし、d-タガトースの生産株として大腸菌を使用すると安全上のリスクがある。したがって、食品グレードの微生物を用いた安全な固定化細胞製造技術の開発は、将来の研究の方向性となる可能性がある。著者は、食品グレードのlactobacillus fermentum cgmcc2921株を用いて、アルギン酸ナトリウム埋め込み法とグルタルアルデヒド架橋法によるd-タガトース生成のための固定化細胞を作製した。ホウ酸を添加した場合、d-ガラクトースからd-タガトースへの変換率は60%に達し、収率は11.1 g/(l・h)である。8回の変換バッチ(合計192時間)では、変換率の有意な低下は見られなかった〔37〕。しかし、工業生産のコスト要求を達成するためには、高密度栽培と生産株の効率的な発現について深く研究しなければなりません。

3.2固定化酵素技術を用いたd-タガトースの生産

固定化酵素技術を用いたd-タガトースの生産は、高い生産強度を達成することができるが、酵素精製工程が煩雑である。kimら[31]は、アルギン酸ナトリウムを用いて好熱性l- ai酵素をカプセル化し、13.3 g/(l・h)の収率でd-タガトースを生成した。ryuら[30]は、アルギン酸ナトリウム埋め込み法を用いて精製したg . stearothermophilusのl- ai酵素を固定化し、その後、packed-bedバイオリアクターを用いてd-タガトースを作製した。反応床の最適な高さと直径の比などを検討した結果、54 g/(l・h)というこれまでの文献で最も高い生産速度を得ることに成功しました。jungらは、固定化酵素技術を用いて得られたd-タガトース収率が高い理由は、精製後、l- ai酵素が固定化後に他の宿主タンパク質によって干渉されず、生物触媒反応が最も理想的な反応傾向で進むことができるためであると考えている。固定化された細胞には大量の宿主タンパク質が含まれているが、これらのタンパク質の存在はかなりの立体障害効果を持ち、その結果、固定化された細胞を使用するとd-タガトース収率が大幅に低下する。

また、固定化l- ai酵素技術は、l- ai酵素の特性を効果的に向上させることもできる。liangら[38]は、アルギン酸ナトリウムを用いてtan由来のl-ai酵素を組み込みました。また、マスラニを添加し、埋め込み後の固定化酵素の最適反応温度を60°cから75°cに大幅に向上させた。5 ~ 8 .0は酵素活性の80%以上を維持することができ、これらのデータは遊離酵素よりもはるかに優れています。jeborsらは、まずnoria / noriapg高分子材料を用いてラクトバチルス・サケイl-ai酵素を固定化し、高温・低ph条件下での安定性が遊離酵素に比べて向上した。

4. 化学反応平衡を変化させることにより、d-タガトースの収率を向上させる

L-AIの反応酵素異性体D-galactose、一部物質親和性が高い製品のD-tagatose(など硼酸団子)と連携できるに業平の反応が減ったため最高の解決策をに対する化学平衡製品形成の革命が起きましたlimら[40]は、最初にd-ガラクトースの変換速度を上げるためにホウ酸を用いた精製された好熱性l- ai酵素を用いたd-タガトースは77.4%であるこれはl- ai酵素を用いて得られる最も高い変換率であり、d-タガトースを調製する。形成されたd-タガトース-ホウ酸錯体はメタノールに可溶であり、ホウ酸は蒸発によって除去することができ、生成物の純度に影響を与えることはありません。したがって、この方法は大きな応用の可能性を秘めています。さらなる研究により、ホウ酸存在下で基質上のl-ai酵素の触媒効率が大幅に向上することが示された。liらは、d-ガラクトース上のアノキシバチルス・フラビサームスl-ai酵素の触媒効率(kcat/ km)が、ホウ酸添加により5.16 mmol/(l・min)から9.47 mmol/(l・min)に83.5%増加したと報告した。

5 l- ai酵素と市販酵素の複合作用によるd-タガトースを含む希少糖混合物の作製

ラクトースは加水分解され、グルコースとd-ガラクトースの等モル混合物を生成する。グルコースはd-タガトースの生成には関与しないため、他の希少糖の生成にも利用できる。ジョージソンら[32]を報告したのが最初使用の原材料として乳糖を混ぜたシロップD-tagatose、果糖用スナイパーなにL - AI酵素β-galactosidaseして、生产を商業ブドウ糖異性化酵素てきd-タガトースを含む混合シロップ乳糖のフルクトースは、ブドウ糖を活用して制品の付加価値を高めるためだ。rhimiら[41]は、アルギン酸ナトリウムを用いて、熱安定性のあるl- ai酵素とグルコースイソメラーゼを共発現させる遺伝子操作細菌を封入し、ラクトース加水分解物を原料とする生物学的充填層を用いて、連続的にd-タガトースとフルクトースを生産することに成功した。しかし、混合シロップ中の成分を分離するには、下流の技術研究の支援が必要であり、現在は探索的な段階にあります。

6 d-タガトースの分離精製

下流技術研究の目標は、d-タガトースの効率的な分離・抽出プロセスを確立することである。変換溶液中のd-タガトースは、有機溶媒で抽出することで分離することができる。xu guiqiangら[42]は、フェニルボロン酸-四級アンモニウムイオン液体溶媒抽出法を用いて、d-タガトースを抽出率65.7%、回収率92.3%で分離した。しかし、食品の安全性の問題や有機溶剤による環境汚染問題などを考慮すると、大規模利用には向かない可能性があります。d-タガトースとd-ガラクトースは異なる形態のアルドペントースであるため、イオン交換樹脂を用いて分離することができる。huang wenxiaら[43]使用ca2 +型イオン交換樹脂に化学的方法で合成したd-タガトースを精製する純度98%、回収率83%のd-タガトースを得ることができます。脱塩したd-タガトースはエタノールとともに結晶化させて純粋なd-タガトースを得ることができる。この方法は操作が簡単で実行可能です。

7 d-タガトースの生物学的生産のための操作方法と装置要件

のd-タガトースの生物学的生産は主にホエイを原料とする。膜分離装置を使ってタンパク質や塩などの不純物を取り除き、ホエイを濃縮します。濃縮ホエイを固定化ラクターゼで加水分解することにより、d-ガラクトースとグルコースの混合物が得られる。混合物中のブドウ糖は、次に微生物(醸造所など)によって発酵されます#39の酵母)、およびエタノールが蒸留されます。残りのd-ガラクトースは、固定化されたl- ai酵素(またはl- ai酵素を含む遺伝子組み換え細菌)によってd-タガトースに変換される。完全に変換されていないd-ガラクトースは、カチオン交換カラムを用いて分離・回収することができる。d-タガトースのみを含む変換液の蒸発・濃縮は、製品の結晶化や乾燥に利用できます。全工程に関わる装置には、膜ろ過装置、発酵装置、遠心分離機(または板型及び枠型フィルタープレス)、蒸留装置、イオン交換樹脂、結晶化装置、乾燥機などがあります。kraft foods inc .&を取って#39;s d-タガトースのバイオプロセス製造方法具体的な操作方法と装置の使用方法を図1に示す[44]。

8 d-タガトースの生物学的生産の問題点と開発の展望

グリーンで低炭素な生産技術として、d-タガトースの生物学的生産プロセスは依然として既存の化学触媒法に取って代わることができない。主な理由は次のとおりである。

1) 高過程費用の。現在の技術の面では、最高の収率d-タガトースは固定化されたl- ai酵素を用いて得られるしかし、酵素精製プロセスは高度な精製装置と複雑なプロセス制御が必要で、維持費が高く、労働集約的であり、技術的な敷石は比較的高い。固定化された組換え大腸菌細胞を用いたd-タガトースの生産は操作が容易であり、その方法は成熟している。欠点は、収量が低く、大腸菌宿主の食品安全性に隠れた危険性があることです。しかし、この方法は依然として最も産業的な見通しを持っています。

2)の反応サイクルd-タガトースを調製する生物学的方法は比較的長い。バッチ変換を使用してdタガトースを製造するのに必要な時間は、通常24時間/バッチまたは最大168時間/バッチであり、プロセス全体を通じて高温環境を維持する必要があります。これは、単純な化学触媒法と比較して、エネルギー消費や反応サイクルの点で利点がありません。室温のl- ai酵素を用いたd-タガトースの製造は、エネルギー消費の点では比較的安価であるが、変換率が20 ~ 30%と低いため、実用価値が低い。

3)食品グレードのl- ai酵素発現ホストの開発と利用の欠如。主な将来的には、食品・医薬品分野への応用が期待されています食品グレード(例えばgras認定)の微生物をバイオ触媒ベクターとして開発する必要がある。候補には枯草菌、gluconobacter oxydans、saccharomyces cerevisiaeなどがある。kimら[45]は、gras認定微生物宿主でgeobacillus sp. l-ai酵素を発現させ、d-タガトースを産生させたが、収量は不明である。rhimiら[46]は、プロバイオティクスのl. bulgaricus株およびs. thermophilus株で、b . stearothermophilus us100 l-ai酵素を発現していた。その結果、ヨーグルトの風味が維持され、カロリーが低下した。

4) l- ai酵素の触媒機構の理解が不十分であり、酵素の触媒特性を効果的に改善することが困難である。l- ai酵素の構造データは非常に限られているため、構造生物学を用いて触媒機構を分析し、酵素工学的修飾を試みることは困難である。より正確な手段として、タンパク質の結晶化技術は、l- ai酵素の基質触媒プロセスの研究にとって非常に重要です。したがって、l- ai酵素の結晶構造解析は今後の重要な課題となる。

もちろん、のための産業プロセスの開発d-タガトースの生産には大きな可能性がある。化学的な製造方法と比較して、生物学的な方法の利点は、製品の抽出の容易さ、高い触媒特異性、社会的に受け入れられた食品の安全性などがあります。d-タガトースを効率的に生産できるl- ai酵素を見つけ出し、d-タガトースを効率的に生産できる安価で安全な生産プロセスを確立するという核心技術開発の青写真も明らかになった。関連研究が深まるにつれて、l- ai酵素を利用してd-タガトースを作る生物学的過程が成熟すると信じている。

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