steviol glycoside rebaudioside aとは?

毎日の食事で糖分を多く摂取することも肥満の原因の一つだ。高血圧、高血糖、および糖尿病などの肥満によって引き起こされる心血管疾患は、世界的にヒトの健康に影響を及ぼす主要な公衆衛生上の危機である[1]。Stevioside is のzero-calorie 甘味料extracted からthe leaves のthe steviのplant, とis known as one のthe “world'の3つの主要な砂糖源」サトウキビ砂糖とビート砂糖[2]と一緒に。ステビア植物の葉の中のステビオシドは、主にステビオシド(st)、レボオーディサイドa (reba)、レボオーディサイドd (reb d)およびレボオーディサイドm (reb m)を含む異なる構造を持つ分子の混合物です[3]。reba)、rebaudioside d (reb d)、rebaudioside m (reb m)など。ステビオシドの甘さはショ糖の250 ~ 350倍で、ショ糖の代わりに新世代のゼロカロリー天然糖源として利用できる[4]。

1990年代以降、欧米の多くの国の食品医薬品規制機関が安全性を評価し、安全な甘味料として高純度(95%以上)ステビオシドを全会一致で承認した[5]。近年、いくつかの臨床試験では、ステビオシドは甘味料としてだけでなく[6]、抗糖尿病、血圧低下、心筋、抗炎症、抗菌、抗腫瘍などのさまざまな健康効果があることが示されている[7]。

これらの健康促進施設は、ステビオサイドに幅広い市場の需要を与えている。研究者は、現在、ステビオシドを抽出し、合成するためのさまざまな新しい方法を開発しています,それは非常にステビオシドの生産と応用を促進してきました[8日本語]。本文は、ステビオシドの安全性と市場の需要を概説し、食品と健康製品の分野でのステビオシドの応用を要約し、ステビオシドの植物抽出と生合成の展望を提供し、ステビオシドの深い研究と工業生産のための理論的な基礎を構築します。

1。 steviosideの安全性と市場の需要

1980年代後半ですsteviosideの安全広く疑問視され、各国はステビオシドの安全性に関する研究を開始しました。.で1995,米国食品医薬品局(fda)栄養補助食品での使用のためのステビアを承認[5]。2008年、2013年、2014年には、reb a、reb d、reb mが、fdaから一般的に安全と認められた(gras)として認められました[11日本語訳]。その後、fao / who合同食品添加物専門家委員会(jecfa)[13]、オーストラリア・ニュージーランド食品規格委員会(fsanz)[14]、欧州食品安全機関(efsa)[15]、インド食品安全規格委員会(fssai)[16]でも、ステビオール配糖体の安全性が認められた。fsanz)[14]、european food safety authority (efsa)[15]、およびfood safety とstandards authority of india (fssai)[16]。2011年、中国の関連部門は、飲料、保存果物、調味料、ペストリーなどの食品に食品添加物としてのステビオシドの使用を正式に承認した[3]。

中国は世界です&#ステビア配糖体の39の最大の生産者。中国ステビア協会によると、2009年、中国' sのステビア栽培面積は、主にステビア原料の約40,000トンの年間生産量で、新疆、甘粛省、内モンゴル、河北省、江蘇省、安徽省、黒龍江省、他の場所に分布し、約16667ヘクタールでした[17]。27以上の省と都市でステビア配糖体の生産が全面的に推進された。中国で生産されるステビオシドの約8割は、日本、韓国、アメリカ、マレーシアなど20カ国以上に輸出されています。中国は現在「ワールド&」です#39;sのsteviosideの最大の輸出国[18]。さらに、ロシア、インド、カナダ、南アフリカ、ケニアなどの国や地域でも、栽培促進のために異なる栽培地域があります[19 - 21]。

現在、steviosideはworld&になっています#ゼロカロリーで39、最も広く使用されている天然高強度甘味料です。ステビオシドはエネルギーバランスを改善し、重量制御を支援することができます。国際ステビオシド協会の統計によると、2016年には、世界で約3,000のステビオシドを含む食品・飲料製品が発売され、消費者数は40億人を超えています[22]。2017年には、甘味料としてステビオシドを使用した食品の数が、甘味料としてアスパルテームを使用した食品の数を上回った。製品、そしてそれらを消費する人々の数は40億人を超えています[22]。2017年には、甘味料としてステビア配糖体を使用した食品の数が、甘味料としてアスパルテームを使用した製品の数を上回った[23]。2027年までに、ステビオシド粉末の世界消費量は、7%から8%の年間成長率で10,254.93トンに達すると推定されている[24]。

Reb A is the most widely used stevioside にthe market. From January 2015 to February 2017, the price of high-purity Reb A (≥95%) rose から73,000 USD/ton to 77,300 USD/ton [23]. In 2017, global marketreached 417 million US dollars. With the advancement of technology とthe development of a new generation of natural sweetener Reb M, it is expected that によって2024, the marketsales of stevia will grow at an annual rate of 8.2% to 721 million US dollars [25]. According to relevant market research reports, the global stevioside market was worth 620.8 million US dollars で2020, とis expected to reach 1.14 billion US dollars by 2028, with a compound annual growth rate (CAGR) of 8.0%. billion US dollars[24] , とthe compound annual growth rate could reach 8.5% by 2030, with a market size of 16.428 billion US dollars[26] .

2ステビオール配糖体アプリケーション

2.1甘味料としてのステビオール配糖体

ステビオール配糖体は、他の甘味料と組み合わせて使用しても良い味を維持するため、食品添加物としてさまざまな割合で食品に使用することができます[27]。ステビオール配糖体の安全性が認識され、広く市場で使用されている。ステビオール配糖体の一般的な形態は、粉末、錠剤および液体であり、飲料、ビール、ベーカリー製品、デリカテン、保存食品、加工された果物および野菜、調味料、冷凍食品、ソース、スナックおよびシリアルなどの食品に天然甘味料として使用することができます[6]。

2013年、コカ・コーラ社はステビア飲料の製造を開始し、カロリーを30%削減した[28]。2018年に発売された「ステビアコーラ」は、白砂糖をステビア糖体で完全に置き換え、白砂糖がもたらす甘くて脂っこく感じを、甘くておいしい甘さに変えた。甘味の必要性を満たしつつ、低糖化も実現している[29]。例えば、果実酒の粘度を変えてより美味しくしたり、ビールの発泡効果を高めて泡を濃く長持ちさせたり[30]。

焼き菓子にスクロースの代わりにステビオール配糖体を使用すると、生地の発酵速度とパンの量を減らし、血糖指数とエネルギー含有量を減らすことによってパンの栄養価を向上させることができます[31]。スクロースの代わりにステビア抽出物の割合を変えて調製したオーツ麦ビスケットの外観、味、香り、食感などの官能特性を評価した。その結果、25%のスクロースと50%のスクロースをステビア抽出物に置換したビスケットが消費者に最も人気があることが示された[27]。

ゼリーやジャムの製造において、砂糖の添加は最終的な甘さに影響を与えるだけでなく、全可溶性固形分を増加させるのにも役立ちます[32]。ゼリーやジャムの中の砂糖は、水やハイドロゲルとゲル化します。スクロースを完全に置換するためにステビオール配糖体を使用すると、ゼリーが適切にセットされず、外観が影響を受けます。スクラロース、ステビオシド、寒天を混ぜるとゼリーが好きなように固まり、ゼリーとジャムのカロリーを下げることができます[33-34]。

ステビア配糖体は、山芋、ドラゴンフルーツ、パパイヤ、グアバ、キウイフルーツ、ならびにクルミ、ピーナッツ、松の実などのナッツから作られた砂糖フリーキャンディー中のショ糖の代わりに使用することができます。ミネラル栄養を提供しながら、彼らはまた、消費者を満足させる'甘さの欲望[35]。ステビオール配糖体とチョコレートのショ糖を交換するだけでなく、元の、満足のいく人々に似た味で無糖チョコレートを生成します'の味のための需要だけでなく、可能な体重増加や糖代謝疾患のリスクを低減[36]。また、ステビオール配糖体は微生物には利用されない。ピクルスや漬物の中でスクロースをステビオール配糖体に置き換えると、微生物の増殖を抑制し、発酵中の腐敗を防ぐことができる[37]。

2.2ステビオール配糖体の健康増進機能

ステビオシドは甘味料としてだけでなく、抗糖尿病性、抗心線維症、抗脂肪肝、抗炎症性、抗菌性、抗腫瘍性など、さまざまな生物活性と健康上の利点を持っています[7]。異なるステビオシドの最終代謝物はすべてステビオールであるため、ステビオールは体内に蓄積しないため、毒性のある副作用を引き起こすことなく健康製品として使用することができます[38]。

steviol配糖体steviol, steviolglucoside, stevioside, rebaudioside aスタキドリンとreb aを用いて、ストレプトゾトシンによって誘発された2型糖尿病マウスに餌を与えた。未治療の2型糖尿病マウスと比較して、ステビオシド誘導体を投与した2型糖尿病マウスでは、インスリン分泌が有意に増加し、肝臓でのグルコース代謝が向上し、肝グリコーゲンの活性化が促進され、血糖濃度と糖化ヘモグロビン(hba1c)濃度が低下し、糖尿病が改善した[39]。

75 ~ 150 mg/kgのstを脂肪肝ラットに6週間投与したところ、実験群のラットでは脂肪肝の程度が有意に低下し、stが血中脂質を低下させることが示された[40]。stを用いて、デキストラン硫酸ナトリウムによる潰瘍性大腸炎、リポ多糖(lps)による致死性ショック、freund&による補助関節炎をマウスに投与した#39の完全なアジュバント(fca)。stは、炎症誘発因子の放出を阻害し、抗炎症性サイトカインの産生を増強し、炎症反応を有意に低下させることがわかった[41]。(Freund&#stは炎症誘発因子の放出を抑制し、抗炎症性サイトカインの産生を増強し、炎症反応を有意に減少させることがわかった[41 43]。

ステビオシドは、抗心線維症、抗菌および抗腫瘍に明らかな有効性を有します。マウスのイソプロテノール誘発性心筋線維症をstで40日間経口投与した後、mice's心筋ヒドロキシプロリンレベルおよび心筋体重指数が低下し、心筋線維症の程度が有意に減少した[44]。20 mg/ mlのstは、大腸菌の成長を阻害することができます。stの濃度を調節することで、枯草菌、aspergillus niger、rhizopus oryzaeなどの生育を抑制することができます[45]。reb aは自己組織化してミセルになる。reb aとホノキオール(hk)を自己組織化ミセルに配合することで、hkの経口バイオアベイラビリティを改善し、抗腫瘍活性を高めることができます。したがって、ステビオシドは疎水性抗腫瘍薬の送達に大きな可能性を秘めている[46]。ステビオール配糖体はまた、ヒドロキシルやスーパーオキシドラジカルなどの活性酸素を除去することができ、高血圧、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、腫瘍などの疾患の治療に使用することができる。

3 .ステビオール配糖体の調製法

3. 1 .ステビオール配糖体の植物抽出

Traditional methods ためextracting steviol glycosidesからplants include hot water extraction, solvent extraction, maceration, とadsorption on macroporous resins [47⁃50]. These methods are not only time-consuming とlaborious, but also relatively inefficient, and they consume excessive solvents and energy [51]. With the development of modern biotechnology, researchers have developed a variety of methods ためextracting steviol glycosidesからnatural stevia.

マイクロ波アシスト抽出(英語版)(mae)はマイクロ波エネルギーを利用して溶媒へのステビオシドの移動を促進する。従来のマセレーション法と比較して、最適動作温度が低く、最適抽出時間がマセレーション法の1/7に短縮されます[49]。超臨界流体抽出(sfe)は、従来のマセレーション技術よりも効率的であるだけでなく、二酸化炭素排出量と溶剤消費量を削減します[52]。

超音波抽出法(uae)は、主に超音波振動を用いて細胞を破壊し、細胞内物質を放出します。他の抽出技術と比較して、この方法はより穏やかな抽出温度を有する[53]。rapid solid-liquid dynamic extraction (rslde)を用いて抽出されるreb aとstは無色透明な液体であるが、従来のマセレーション法を用いて抽出される生成物は濃い黄色である。rslde法は、ステビオシドの生産量を増加させるだけでなく、その後の精製工程を削減し、ステビオシドの生産コストを削減することができる[54]。上記の抽出方法はまだ実験室での研究段階にあり、産業用アプリケーションのコストを削減するためにさらなる研究が必要である[49,53]。

ステビアの葉に含まれるステビオールとレボオーディシドaの含有量は最も高く,葉の乾燥重量に占める割合はそれぞれ5 ~ 10%と2 ~ 4%である[55]。したがって、既存の抽出技術で得られた生成物の主な成分は、ステビオールとレボオーディサイドaです。reb dとreb mは、ステビア葉の乾燥重量のわずか0.4 ~ 0.5%を占める非常に低いレベルで存在するため、ステビアから直接reb dとreb mを抽出するのは非効率でコストがかかります[9,56]。

3. 2ステビオシドの生合成

Direct extraction of stevioside from plants is often affected by the content of stevioside and the 植物growth cycle. In recent years, researchers have used techniques such as genome sequencing and expressed sequence tags (ESTs) to reveal the maでsynthesis pathways of steviosides でnatural stevia [10, 57], laying the foundation for the heterologous production of steviosides using synthetic biology. Studies have shown that the main difference between different types of steviol glycosideslies in the number and position of the sugar groups, which results in different sweetness and mouthfeel [58]. The trisaccharide St and the tetrasaccharide Reb A are 250 to 300 times sweeter than sucrose, with a slight aftertaste [59]; the pentasaccharide Reb D and the hexasaccharide Reb M are 350 times sweeter than sucrose, with almost no aftertaste and a better taste [9].

南軍の主要合成経路Dおよび共同でステビア南M・メーカーは以下の通り:steviolによって解媒glycosyl transferases SrUGT85C2の糖分がブドウ糖を転写グループにSrUGT74G1ドナーuridinediphosphateブドウ糖(UDP-glucose) C13-hydroxylグループβを介してsteviolの骨格の-D-glucosideた絆だブドウ糖(uridinediphosphateブドウ糖、UDPG) C13-hydroxylとC19-carboxyl職能団体βを介してsteviolの骨格の-D-glucoside債券rubusosideを形成(こすっ)[60];C13-glycosyl rubusoside形派1、2、-β-D-glycosidic債券煤油炉の下を形成するために、glycosyl SrUGT91D2アシル基の転移酵素St [61];「St形成のC13-glucosylグループ1、3、-β-D-glycosidic債券の煤油炉下glycosyl SrUGT76G1アシル基の転移酵素同時に編成の1・3β-D-glycosidic債券南軍を生成する[56];reb aのc19位のグルコシル基は、srugt91d2とsrugt76g1によって連続的に触媒され、reb dとreb mを生成する(図1)[61]。

ステビオシドの生物学的変換は、現在ステビオシドの工業生産を達成するための最も費用対効果の高い方法である。(1)糖転移酵素遺伝子を過剰発現させ、グルコースを炭素源とするステビオシドを異種合成することにより、微生物におけるステビオシド合成経路を構築する。(2)バイオ触媒を用いたステビオシドの合成。

3. 2. 1 ステビオシドのデノボ合成

構築するメバロン酸(MVA)大腸菌での生産経路:次に绍介するテルペンモジュールをgeranylリン酸シンターゼを司る遺伝子がcyclopentapropanoylリン酸シンターゼkaureneシンターゼ、を含むシトクロームP450モジュールdiaglycolateオキシダーゼを司る遺伝子がkaurene 13α-hydroxylaseシトクロームP450還元酵素、13α-hydroxylaseシトクロームP450還元酵素、構成されたglycosyltransferaseモジュールなどglycosyltransferases SrUGT85C2、sr ugt91d2w, srugt74g1, srugt76g1,得られた株ssy10 psy447は、5日以内にreb aの10.03 mg/ lを一から合成することができます[61]。

ugt76g1変異体はugt76g1の4倍のreb dを産生し、ugt76g1 lys337proとugt76g1thr55lys変異体はいずれもugt76g1の4倍のreb mを産生する(図1)。ugt76g1の4倍でした。変異体ugt76g1 lys337proとugt76g1thr55lysは、reb mの産生能力を約20%向上させ、reb gやreb qなどの副生成物の産生をほぼ抑制した[9]。

従来の植物抽出法や化学合成法に比べ、人工的に設計されたステビオール配糖体のデ・ノボ合成法は、特定のステビオール配糖体を所望の経路で短時間で、かつ環境に優しい方法で生産することができる。しかしながら、微生物によるステビオール配糖体のデ・ノボ合成は多くの触媒反応ステップを伴うため、いくつかの重要なステップにおける微生物の酵素の発現量は低く、活性も低いため、一般的にステビオール配糖体の収率は低い。

3. 2. 2ステビオシドの生体触媒合成

ステビオシドの生物触媒合成(biocatalytic synthesis of stevioside)は、ステビオシドの合成のために酵素または酵素を産生する微生物を触媒として用いるプロセスである。stevia ugt76g1はstからのreb aの生成を触媒することができる[9]。糖転移酵素ugt76g1は、アンカータンパク質gcw61pを用いてピヒア・パストリスgs115の表面に発現する。組換え株はstを基質とし,udpgをグリコシン供与体とし,全細胞を触媒してreb aを生成する。その変換率は約70.37%である[62]。udpgは高価であるため、触媒反応のコストを下げるために、研究者らはシロイヌナズナのスクロス合成酵素atsus1を共同発現させ、ソルガムのu gt76g1を大腸菌で共同発現させた。atsus1の粗酵素溶液はスクロスとウリジン二リン酸(udp)のudpgへの変換を触媒し、組換え酵素srugt76g1はstを基質とするreb aの合成を触媒した[58]。この方法では、安価なudpとスクロスを基質としてudpgをin situで合成することで、ステビオシドの工業生産コストをさらに低減することができます(図2)[11,58]。

stevia rebaudianaugt91d2は、rebaからのreb dの生成を触媒することができます[10]。しかし、現在、組換え酵素srugt91d2についての研究はありません。研究者らは、大腸菌でトマト糖転移酵素ugtsl2を発現させ、その組換え酵素はreb aから基質としてreb dとreb m2を生産することに成功した[63]。reb m2はreb mの異性体であり、安全性は確認されていない[16]。

さらにugtsl2の飽和変異体を作製したところ、asn358pheの触媒活性が21.9%上昇したが、生成物中には少量のreb m2が残っていた[64]。9%であったが、少量のreb m2が製品に残っていた[64]。のglycosyltransferase EUGT11米(向谷実sativa)と大腸菌Pichia pastoris组换え株を得るXE⁃3 BL21 (pET28a ~ⅣOsEUGT 11)。xeが発現する組み換え酵素eugt11は、udpgを糖供与体としてph 6.0 - 6.5のリン酸ナトリウム緩衝液中で45°cで最も高い触媒活性を示す。bl21によって発現された組み換え酵素eugt11 (pet28a-oseugt11)は、ph 8.5のトリス塩酸緩衝液中で35°cで最も高い触媒活性を示す[65]。

ピヒア・パストリスで発現した組み換えeugt11は、大腸菌で発現した組み換え酵素よりも高い耐酸性と熱安定性を有する[65]。直交設計を用いて開発された2段階の温度制御法を用いて、xe 3系統におけるreb dの生産を最適化しました。xeは、3 - 4 dで、0.75%のメタノールとph 5のbmmy培地~を28°cで含有するbmmy培地中で培養し、約790 mg/ l oseugt11の標的タンパク質を得ました。続いて、reb aと糖供与体udpgを細菌培養液に添加し、xeステージ3組換え株の全細胞がreb aから特異的にreb dを産生する触媒反応を35°c、4 dで行い、収率は93.47%であった。

この方法により、タンパク質の分離・精製工程が簡単になります(図3)[65]。より活性の高い新しい糖転移酵素を発見するために、相同配列比較、ドメイン解析、三次構造シミュレーションなどのバイオインフォマティクスの手法を組み合わせて、capsicum annuumのcaugtとsolanum tuberosumのstugtをスクリーニングした。大腸菌な表現だ。両方とも酵素组换えCaUGT StUGT、移植できる時としてUDPG砂糖を使わを使って南軍のへの転換など南軍D .しかし、触媒组换えの産物酵素CaUGT副産物南軍M2に含まれており、具体的には触媒となる见ながら组换え酵素StUGT変換の南D・加増により南の97%[66]運河。

reb dからreb mへの変換を触媒する糖転移酵素は、srugt76g1以外には見つかっていない[67]。大腸菌で発現した組換えsrugt76g1は、reb dからreb mへの変換率72.2%を触媒することができる。srugt76g1t284s変異体はreb dからreb mへの変換を約50%増加させた[68]。大腸菌で発現しているsrugt76g1は、糖転移酵素の効率的な生産に影響を与える封入体を形成しやすい[65]。研究チームは、srugt76g1のc末端に短い酸性ペプチドタグを融合させ、4つの酸-尾融合酵素を得た。これにより、大腸菌におけるsrugt76g1の可溶性発現レベル、熱安定性、触媒活性が改善された。酸性c末端融合酵素は、ph 9.0でグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液中の基質としてreb dとudpgを用いてreb mの生成を触媒する際、野生型の活性の202.46%を有する[69]。

安価な基質からの高付加価値ステビオシドの直接生産を触媒し、反応時間を短縮し、生産コストを削減するために、研究者らは多酵素カスケードシステムを開発した。oseugt11、srugt76g1、およびシロイヌナズナのスクロース合成酵素atsus3が共発現すると、組換え細菌はreb a、udp、およびスクロースから基質としてreb mを直接生産することができます[68]。むしろスクラム组换え細菌の遺伝コードSrUGT76G1そのthreonine位置284はを高めるため、セリンに比と変異whole-cell触媒製品南軍をM南軍D 1:3.9から7:1中間製品。南軍Dの割合を下げる・生産高を増加させ、[68]南M。酵素固定化技術は、酵素の再利用性を高め、酵素反応のコストを削減することができます。

グルタルアルデヒドを架橋剤、キトサンを担体とし、大腸菌で発現したoseugt11とsrugt76g1をキトサン微小球に共有結合させることで、組換え酵素の貯蔵安定性と再利用性を向上させることができた。しかし、reb mの生産は、高価なreb d基板のために制限されている。研究チームは、安価なreb aから直接reb mを一段階で生成するために、キトサン上にoseugt11とsrugt76g1を同時に固定化するカスケード反応を構築した。得られた共固定化酵素は、糖供与体としてudpgを用いる。燐酸ナトリウムをバッファでマグニチュード7.0 pH 3 mmol / L MgCl2た南軍を直接的に解媒生成することができる南M・機能より積極的3.2倍と混合燐酸個人(図4)。固定化ナトリウムのバッファ3 mmol / L MgCl2を加え、南軍直接できる南軍に改宗してM×酵素で煤油炉、同イベントは3.2倍以上ミックスされたシステム(図4)一人で成功生産コストを下げ、[63]南M。

要約すると、バイオ触媒技術は操作が簡単で、触媒特異性が高く、副生成物が少ないため、その後の分離精製が容易になり、ステビオール配糖体の工業生産が容易になる[70]。

4まとめと展望

新しいタイプとしてzero-calorie natural sweetener, the food and medicinal value of stevioside is also being continuously explored. In 2018, Reb D and Reb M, which are even sweeter, received widespread attention and are expected to replace Reb A as a new generation of natural sweeteners. However, the content of Reb D and Reb M in stevia is extremely low, and the cost of extracting and purifying them from plants is high, which limits their アプリケーションand development.

このステビオシドの生合成は、reb dおよびreb mの効率的な生産を促進する重要な方法である。将来的には、以下の方法で生合成効率を向上させることができる。バイオインフォマティクスは、新しいタイプの高効率の糖転移酵素を発見するために使用することができます。(2)合成生物学技術を利用して経路建設中のブドウ糖南軍をD南軍Mを合成して読み出す微生物細胞大腸菌など、南軍Dの歩留まりを上げると南軍Mに関連代謝ネットワークが規制され最適化遺伝子規制要素および発展途上国などで収量を増やしたR e b D R e b M、(3)ステビオシドの生産コストを削減するための固定化技術、全細胞触媒技術、多酵素カスケード技術、補酵素再生技術を開発し、市場投入を加速する。

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