steviol glycoside rebaudioside aとは?

毎日の食事で糖分を多く摂取することも肥満の原因の一つだ。高血圧、高血糖、および糖尿病などの肥満によって引き起こされる心血管疾患は、世界的にヒトの健康に影響を及ぼす主要な公衆衛生上の危機である[1]。ステビオシドはゼロカロリーの甘味料です植物のステビアの葉から抽出され、「ワールド&」の一つとして知られています#39の3つの主要な砂糖源」サトウキビ砂糖とビート砂糖[2]と一緒に。ステビア植物の葉の中のステビオシドは、主にステビオシド(st)、レボオーディサイドの(reba)、レボオーディサイドd (reb d)およびレボオーディサイドm (reb m)を含む異なる構造を持つ分子の混合物です[3]。reba)、rebaudioside d (reb d)、rebaudioside m (reb m)など。ステビオシドの甘さはショ糖の250 ~ 350倍で、ショ糖の代わりに新世代のゼロカロリー天然糖源として利用できる[4]。

1990年代以降、欧米の多くの国の食品医薬品規制機関で安全性が評価され、高純度(95%以上)が全会一致で承認されている。安全な甘味料としてステビオシド[5]。近年、いくつかの臨床試験では、ステビオシドは甘味料としてだけでなく[6]、抗糖尿病、血圧低下、心筋、抗炎症、抗菌、抗腫瘍などのさまざまな健康効果があることが示されている[7]。

これらの健康促進施設は、ステビオサイドに幅広い市場の需要を与えている。研究者は、現在、ステビオシドを抽出し、合成するためのさまざまな新しい方法を開発しています,それは非常にステビオシドの生産と応用を促進してきました[8日本語]。本稿では、ステビオシドの安全性と市場の需要を概観し、食品・健康用品分野でのステビオシドの応用について総括し、今後の展望を述べる植物抽出とステビオシドの生合成,深い研究とsteviosideの工業生産のための理論的な基盤を築く。

1. steviosideの安全性と市場の需要

1980年代後半ですsteviosideの安全広く疑問視され、各国はステビオシドの安全性に関する研究を開始しました。.で1995,米国食品医薬品局(fda)栄養補助食品での使用のためのステビアを承認[5]。2008年、2013年、2014年には、reb a、reb d、reb mが、fdaから一般的に安全と認められた(gras)として認められました[11日本語訳]。その後、fao / who合同食品添加物専門家委員会(jecfa)[13]、オーストラリア・ニュージーランド食品規格委員会(fsanz)[14]、欧州食品安全機関(efsa)[15]、インド食品安全規格委員会(fssai)[16]でも、ステビオール配糖体の安全性が認められた。fsanz)[14]、european food safety authority (efsa)[15]、およびfood safety とstandards authority のindiの(fssai)[16]。2011年、中国の関連部門は、飲料、保存果物、調味料、ペストリーなどの食品に食品添加物としてのステビオシドの使用を正式に承認した[3]。

中国は世界です'ですステビア配糖体の最大の生産者。中国ステビア協会によると、2009年、中国' sのステビア栽培面積は、主にステビア原料の約40,000トンの年間生産量で、新疆、甘粛省、内モンゴル、河北省、江蘇省、安徽省、黒龍江省、他の場所に分布し、約16667ヘクタールでした[17]。27以上の省と都市でステビア配糖体の生産が全面的に推進された。中国で生産されるステビオシドの約8割は、日本、韓国、アメリカ、マレーシアなど20カ国以上に輸出されています。中国は現在「ワールド&」です#39;sのsteviosideの最大の輸出国[18]。さらに、ロシア、インド、カナダ、南アフリカ、ケニアなどの国や地域でも、栽培促進のために異なる栽培地域があります[19 - 21]。

現在、steviosideはworld&になっています#ゼロカロリーで39、最も広く使用されている天然高強度甘味料です。ステビオシドはエネルギーバランスを改善できます体重をコントロールするのに役立ちます国際ステビオシド協会の統計によると、2016年には、世界で約3,000のステビオシドを含む食品・飲料製品が発売され、消費者数は40億人を超えています[22]。2017年には、甘味料としてステビオシドを使用した食品の数が、甘味料としてアスパルテームを使用した食品の数を上回った。製品、そしてそれらを消費する人々の数は40億人を超えています[22]。2017年には、甘味料としてステビア配糖体を使用した食品の数が、甘味料としてアスパルテームを使用した製品の数を上回った[23]。2027年までに、ステビオシド粉末の世界消費量は、7%から8%の年間成長率で10,254.93トンに達すると推定されている[24]。

reb aは市場で最も広く使用されているステビオシドです。2015年1月から2017年2月までの間に、高純度reb a(95%以上)の価格は73,000米ドル/トンから77,300米ドル/トンに上昇しました[23]。2017年の世界市場は4億1700万ドルに達しました。技術の進歩と新世代の天然甘味料reb mの開発により、2024年までにステビアの市場売上高は8.2%の年間成長率で7億2100万米ドルになると予想されています[25]。関連する市場調査報告書によると、世界のステビオシド市場は2020年に6億2080万ドルの価値があり、2028年までに11億4000万ドルに達し、複合年平均成長率(cagr)は8.0%になると予測されています。10億米ドル[24]、そして複合年間成長率は2030年までに8.5%に達し、市場規模は164億2800万米ドル[26]に達する可能性がある。

2ステビオール配糖体アプリケーション

2.1甘味料としてのステビオール配糖体

ステビオール配糖体は食品に用いられる[27]他の甘味料と組み合わせて使用すると、まだ良い味を維持するため、食品添加物として異なる割合で。ステビオール配糖体の安全性が認識され、広く市場で使用されている。ステビオール配糖体の一般的な形態は、粉末、錠剤および液体であり、飲料、ビール、ベーカリー製品、デリカテン、保存食品、加工された果物および野菜、調味料、冷凍食品、ソース、スナックおよびシリアルなどの食品に天然甘味料として使用することができます[6]。

2013年、コカ・コーラ社はステビア飲料の製造を開始し、カロリーを30%削減した[28]。2018年に発売された「ステビアコーラ」は、白砂糖をステビア糖体で完全に置き換え、白砂糖がもたらす甘くて脂っこく感じを、甘くておいしい甘さに変えた。甘味の必要性を満たしつつ、低糖化も実現している[29]。ステビオシドは基質の粘度を下げることができるいくつかのアプリケーションシナリオでは、フルーツワインをより美味しくするために粘度を変更したり、ビールの発泡効果を高めて泡を濃く長持ちさせたりします[30]。

の焼き菓子におけるスクロースの代わりにステビオール配糖体の使用パン生地の発酵速度とパンの容積を減らすことができ、血糖指数とエネルギー含有量を減らすことによってパンの栄養価を向上させる[31]。スクロースの代わりにステビア抽出物の割合を変えて調製したオーツ麦ビスケットの外観、味、香り、食感などの官能特性を評価した。その結果、25%のスクロースと50%のスクロースをステビア抽出物に置換したビスケットが消費者に最も人気があることが示された[27]。

ゼリーやジャムの製造において、砂糖の添加は最終的な甘さに影響を与えるだけでなく、全可溶性固形分を増加させるのにも役立ちます[32]。ゼリーやジャムの中の砂糖は、水やハイドロゲルとゲル化します。スクロースを完全に置換するためにステビオール配糖体を使用すると、ゼリーが適切にセットされず、外観が影響を受けます。アセスルファムカリウムときステビオシドと寒天を併用するゼリーが好きなようにセットでき、ゼリーやジャムのカロリーを抑えることができます[33-34]。

ステビア配糖体は、糖を含まないスクロースの代わりに使用することができる山芋、ドラゴンフルーツ、パパイヤ、グアバ、キウイなどの果物や、くるみ、落花生、松の実などのナッツを使ったお菓子です。ミネラル栄養を提供しながら、彼らはまた、消費者を満足させる'甘さの欲望[35]。ステビオール配糖体とチョコレートのショ糖を交換するだけでなく、元の、満足のいく人々に似た味で無糖チョコレートを生成します'の味のための需要だけでなく、可能な体重増加や糖代謝疾患のリスクを低減[36]。また、ステビオール配糖体は微生物には利用されない。ピクルスや漬物の中でスクロースをステビオール配糖体に置き換えると、微生物の増殖を抑制し、発酵中の腐敗を防ぐことができる[37]。

2.2ステビオール配糖体の健康増進機能

ステビオシドは甘味料としてだけではありませんしかし、また、抗糖尿病、抗心線維症、抗脂肪肝、抗炎症、抗菌、抗腫瘍特性などの生物学的活性と健康上の利点の様々なを持っています[7]。異なるステビオシドの最終代謝物はすべてステビオールであるため、ステビオールは体内に蓄積しないため、毒性のある副作用を引き起こすことなく健康製品として使用することができます[38]。

steviol配糖体steviol, steviolglucoside, stevioside, rebaudioside aスタキドリンとreb aを用いて、ストレプトゾトシンによって誘発された2型糖尿病マウスに餌を与えた。未治療の2型糖尿病マウスと比較して、ステビオシド誘導体を投与した2型糖尿病マウスでは、インスリン分泌が有意に増加し、肝臓でのグルコース代謝が向上し、肝グリコーゲンの活性化が促進され、血糖濃度と糖化ヘモグロビン(hba1c)濃度が低下し、糖尿病が改善した[39]。

75 ~ 150 mg/kgのstを脂肪肝ラットに6週間投与したところ、実験群のラットでは脂肪肝の程度が有意に低下し、stが血中脂質を低下させることが示された[40]。stを用いて、デキストラン硫酸ナトリウムによる潰瘍性大腸炎、リポ多糖(lps)による致死性ショック、freund&による補助関節炎をマウスに投与した#39の完全なアジュバント(fca)。stは、炎症誘発因子の放出を阻害し、抗炎症性サイトカインの産生を増強し、炎症反応を有意に低下させることがわかった[41]。(Freund&#stは炎症誘発因子の放出を抑制し、抗炎症性サイトカインの産生を増強し、炎症反応を有意に減少させることがわかった[41 43]。

ステビオシドは抗心線維症に有効である抗菌・抗腫瘍剤ですマウスのイソプロテノール誘発性心筋線維症をstで40日間経口投与した後、mice's心筋ヒドロキシプロリンレベルおよび心筋体重指数が低下し、心筋線維症の程度が有意に減少した[44]。20 mg/ mlのstは、大腸菌の成長を阻害することができます。stの濃度を調節することで、枯草菌、aspergillus niger、rhizopus oryzaeなどの生育を抑制することができます[45]。reb aは自己組織化してミセルになる。reb aとホノキオール(hk)を自己組織化ミセルに配合することで、hkの経口バイオアベイラビリティを改善し、抗腫瘍活性を高めることができます。したがって、ステビオシドは疎水性抗腫瘍薬の送達に大きな可能性を秘めている[46]。ステビオール配糖体はまた、ヒドロキシルやスーパーオキシドラジカルなどの活性酸素を除去することができ、高血圧、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、腫瘍などの疾患の治療に使用することができる。

3 .ステビオール配糖体の調製法

3. 1 .ステビオール配糖体の植物抽出

伝統的な方法抽出steviol glycosides植物からは、熱湯抽出、溶媒抽出、マセレーション、およびマクロポーラス樹脂への吸着が含まれます[47 - 50]。これらの方法は、時間と労力がかかるだけでなく、相対的に非効率であり、過剰な溶媒とエネルギーを消費する[51]。現代のバイオテクノロジーの発展に伴い、研究者は天然ステビアからステビオール配糖体を抽出するための様々な方法を開発した。

マイクロ波アシスト抽出(英語版)(mae)はマイクロ波エネルギーを利用して溶媒へのステビオシドの移動を促進する。従来のマセレーション法と比較して、最適動作温度が低く、最適抽出時間がマセレーション法の1/7に短縮されます[49]。超臨界流体抽出(sfe)は、従来のマセレーション技術よりも効率的であるだけでなく、二酸化炭素排出量と溶剤消費量を削減します[52]。

超音波抽出法(uae)は、主に超音波振動を用いて細胞を破壊し、細胞内物質を放出します。他の抽出技術と比較して、この方法はより穏やかな抽出温度を有する[53]。rapid solid-liquid dynamic extractiに(rslde)を用いて抽出されるreb aとstは無色透明な液体であるが、従来のマセレーション法を用いて抽出される生成物は濃い黄色である。rslde法は、ステビオシドの生産量を増加させるだけでなく、それによってその後の生成物の精製工程を削減するステビオサイドの生産コストを削減します[54]。上記の抽出方法はまだ実験室での研究段階にあり、産業用アプリケーションのコストを削減するためにさらなる研究が必要である[49,53]。

steviolとrebaudioside aの内容ステビアの葉が最も多く、葉の乾燥重量の5 ~ 10%と2 ~ 4%を占めるそれぞれ[55)。したがって、既存の抽出技術で得られた生成物の主な成分は、ステビオールとレボオーディサイドaです。reb dとreb mは、ステビア葉の乾燥重量のわずか0.4 ~ 0.5%を占める非常に低いレベルで存在するため、ステビアから直接reb dとreb mを抽出するのは非効率でコストがかかります[9,56]。

3. 2ステビオシドの生合成

植物からのステビオシドの直接抽出は、多くの場合、ステビオシドの含有量と植物の成長サイクルによって影響を受けます。近年、天然ステビアにおけるステビオシドの主な合成経路を明らかにするために、ゲノムシーケンシングや配列タグ(est)の発現などの手法が用いられ[10,57]、ステビオシドの異種間生産の基盤が確立されてきました合成生物学を専門とする。様々な種類のステビオール配糖体の主な違いは、糖基の数と位置にあり、その結果甘味と口当たりが異なることが研究で示されている[58]。三糖stと四糖reb aは、スクロースの250 ~ 300倍甘く、わずかな後味がある[59];五糖のreb dと六糖のreb mは、スクロースの350倍も甘く、後味がほとんどなく、味が良い[9]。

主reb dとreb mの合成経路ステビアでは以下の通り。steviolによって解媒glycosyl transferases SrUGT85C2の糖分がブドウ糖を転写グループにSrUGT74G1ドナーuridinediphosphateブドウ糖(UDP-glucose) C13-hydroxylグループβを介してsteviolの骨格の-D-glucosideた絆だブドウ糖(uridinediphosphateブドウ糖、UDPG) C13-hydroxylとC19-carboxyl職能団体βを介してsteviolの骨格の-D-glucoside債券rubusosideを形成(こすっ)[60];C13-glycosyl rubusoside形派1、2、-β-D-glycosidic債券煤油炉の下を形成するために、glycosyl SrUGT91D2アシル基の転移酵素St [61];「St形成のC13-glucosylグループ1、3、-β-D-glycosidic債券の煤油炉下glycosyl SrUGT76G1アシル基の転移酵素同時に編成の1・3β-D-glycosidic債券南軍を生成する[56];reb aのc19位のグルコシル基は、srugt91d2とsrugt76g1によって連続的に触媒され、reb dとreb mを生成する(図1)[61]。

のbiotransformation steviosideの現在、ステビオシドの工業生産を達成するための最も費用対効果の高い方法です。(1)糖転移酵素遺伝子を過剰発現させ、グルコースを炭素源とするステビオシドを異種合成することにより、微生物におけるステビオシド合成経路を構築する。(2)バイオ触媒を用いたステビオシドの合成。

3. 2. 1 ステビオシドのデノボ合成

構築するメバロン酸(MVA)大腸菌での生産経路:次に绍介するテルペンモジュールをgeranylリン酸シンターゼを司る遺伝子がcyclopentapropanoylリン酸シンターゼkaureneシンターゼ、を含むシトクロームP450モジュールdiaglycolateオキシダーゼを司る遺伝子がkaurene 13α-hydroxylaseシトクロームP450還元酵素、13α-hydroxylaseシトクロームP450還元酵素、構成されたglycosyltransferaseモジュールなどglycosyltransferases SrUGT85C2、sr ugt91d2w, srugt74g1, srugt76g1,得られた株ssy10 psy447は、5日以内にreb aの10.03 mg/ lを一から合成することができます[61]。

合成の経路はステビオールをレブmにugt76g1変異体leu257glyはugt76g1の4倍のreb dを産生し、ugt76g1 lys337proおよびugt76g1thr55lys変異体はいずれもugt76g1の4倍のreb mを産生する(図1)。ugt76g1の4倍でした。変異体ugt76g1 lys337proとugt76g1thr55lysは、reb mの産生能力を約20%向上させ、reb gやreb qなどの副生成物の産生をほぼ抑制した[9]。

伝統的な植物抽出と化学合成法と比較して、人工的に設計されたのデノボ合成ステビオール配糖体は特異的なステビオール配糖体を生成することができるより短時間で、そして環境に優しい方法で予想されるルートで。しかしながら、微生物によるステビオール配糖体のデ・ノボ合成は多くの触媒反応ステップを伴うため、いくつかの重要なステップにおける微生物の酵素の発現量は低く、活性も低いため、一般的にステビオール配糖体の収率は低い。

3. 2. 2ステビオシドの生体触媒合成

Biocatalyticステビオシド合成(英語:synthesis のstevioside)とは、酵素を用いた合成のことであるステビオシドの合成のための触媒として酵素を生産する微生物ですstevia ugt76g1はstからのreb aの生成を触媒することができる[9]。糖転移酵素ugt76g1は、アンカータンパク質gcw61pを用いてピヒア・パストリスgs115の表面に発現する。組換え株はstを基質とし,udpgをグリコシン供与体とし,全細胞を触媒してreb aを生成する。その変換率は約70.37%である[62]。udpgは高価であるため、触媒反応のコストを下げるために、研究者らはシロイヌナズナのスクロス合成酵素atsus1を共同発現させ、ソルガムのu gt76g1を大腸菌で共同発現させた。atsus1の粗酵素溶液はスクロスとウリジン二リン酸(udp)のudpgへの変換を触媒し、組換え酵素srugt76g1はstを基質とするreb aの合成を触媒した[58]。この方法では、安価なudpとスクロスを基質としてudpgをでsituで合成することで、ステビオシドの工業生産コストをさらに低減することができます(図2)[11,58]。

ステビアrebaudianaUGT91D2できるreb aからreb dの生成を触媒する[10]。しかし、現在、組換え酵素srugt91d2についての研究はありません。研究者らは、大腸菌でトマト糖転移酵素ugtsl2を発現させ、その組換え酵素はreb aから基質としてreb dとreb m2を生産することに成功した[63]。reb m2はreb mの異性体であり、安全性は確認されていない[16]。

さらにugtsl2の飽和変異体を作製したところ、asn358pheの触媒活性が21.9%上昇したが、生成物中には少量のreb m2が残っていた[64]。9%であったが、少量のreb m2が製品に残っていた[64]。のglycosyltransferase EUGT11米(向谷実sativa)と大腸菌Pichia pastoris组换え株を得るXE⁃3 BL21 (pET28a ~ⅣOsEUGT 11)。xe 3によって発現される組換え酵素eugt11は、最も高い触媒活性を有するrebの生産d45°c、ph 6.0 ~ 6.5のリン酸ナトリウム緩衝液中で、udpgを糖供与体とする。bl21によって発現された組み換え酵素eugt11 (pet28a-oseugt11)は、ph 8.5のトリス塩酸緩衝液中で35°cで最も高い触媒活性を示す[65]。

ピヒア・パストリスで発現した組み換えeugt11は、大腸菌で発現した組み換え酵素よりも高い耐酸性と熱安定性を有する[65]。直交設計を用いて開発された2段階の温度制御方法を使用しましたreb dの生産を最適化するゼッケンはg3。xeは、3 - 4 dで、0.75%のメタノールとph 5のbmmy培地~を28°cで含有するbmmy培地中で培養し、約790 mg/ l oseugt11の標的タンパク質を得ました。続いて、reb aと糖供与体udpgを細菌培養液に添加し、xeステージ3組換え株の全細胞がreb aから特異的にreb dを産生する触媒反応を35°c、4 dで行い、収率は93.47%であった。

この方法により、タンパク質の分離・精製工程が簡単になります(図3)[65]。より活性の高い新しい糖転移酵素を発見するために、相同配列比較、ドメイン解析、三次構造シミュレーションなどのバイオインフォマティクスの手法を組み合わせて、capsicum annuumのcaugtとsolanum tuberosumのstugtをスクリーニングした。大腸菌な表現だ。両方とも酵素组换えCaUGT StUGT、移植できる時としてUDPG砂糖を使わを使って南軍のへの転換など南軍D .しかし、触媒组换えの産物酵素CaUGT副産物南軍M2に含まれており、具体的には触媒となる见ながら组换え酵素StUGT変換の南D・加増により南の97%[66]運河。

reb dからreb mへの変換を触媒する糖転移酵素は、srugt76g1以外には見つかっていないreb dからreb mへの変換率72.2%[67]。srugt76g1t284s変異体はreb dからreb mへの変換を約50%増加させた[68]。大腸菌で発現しているsrugt76g1は、糖転移酵素の効率的な生産に影響を与える封入体を形成しやすい[65]。研究チームは、srugt76g1のc末端に短い酸性ペプチドタグを融合させ、4つの酸-尾融合酵素を得た。これにより、大腸菌におけるsrugt76g1の可溶性発現レベル、熱安定性、触媒活性が改善された。酸性c末端融合酵素は、ph 9.0でグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液中の基質としてreb dとudpgを用いてreb mの生成を触媒する際、野生型の活性の202.46%を有する[69]。

安価な基質からの高付加価値ステビオシドの直接生産を触媒し、反応時間を短縮し、生産コストを削減するために、研究者らは多酵素カスケードシステムを開発した。oseugt11、srugt76g1、シロイヌナズナのスクロース合成酵素atsus3が共発現すると、組換え細菌はそれを可能にするreb aからreb mの生産を直接触媒する、udp、および基質としてのsucrose[68]。むしろスクラム组换え細菌の遺伝コードSrUGT76G1そのthreonine位置284はを高めるため、セリンに比と変異whole-cell触媒製品南軍をM南軍D 1:3.9から7:1中間製品。南軍Dの割合を下げる・生産高を増加させ、[68]南M。酵素固定化技術は、酵素の再利用性を高め、酵素反応のコストを削減することができます。

グルタルアルデヒドを架橋剤、キトサンを担体とし、大腸菌で発現したoseugt11とsrugt76g1をキトサン微小球に共有結合させることで、組換え酵素の貯蔵安定性と再利用性を向上させることができた。しかし、reb mの生産は、高価なreb d基板のために制限されている。そのためには安価なreb aからreb mを生成する研究チームは、oseugt11とsrugt76g1を同時にキトサンに固定化することでカスケード反応を構築した。得られた共固定化酵素は、糖供与体としてudpgを用いる。燐酸ナトリウムをバッファでマグニチュード7.0 pH 3 mmol / L MgCl2た南軍を直接的に解媒生成することができる南M・機能より積極的3.2倍と混合燐酸個人(図4)。固定化ナトリウムのバッファ3 mmol / L MgCl2を加え、南軍直接できる南軍に改宗してM×酵素で煤油炉、同イベントは3.2倍以上ミックスされたシステム(図4)一人で成功生産コストを下げ、[63]南M。

要約すると、バイオ触媒技術は操作が簡単で、触媒特異性が高く、副生成物が少ないため、その後の分離精製が容易になり、ステビオール配糖体の工業生産が容易になる[70]。

4まとめと展望

新しいタイプとしてゼロカロリーの天然甘味料、食品やステビオシドの薬効継続的に調査されています2018年にはさらに甘みの強い「reb d」と「reb m」が注目され、次世代の天然甘味料として「reb a」に代わるものとして期待されています。しかし、ステビアに含まれるreb dとreb mは含有量が極めて低く、植物から抽出・精製するコストが高いため、その応用・開発が制限されていました。

このステビオシドの生合成は、reb dおよびreb mの効率的な生産を促進する重要な方法である。将来的には、以下の方法で生合成効率を向上させることができる。バイオインフォマティクスは、新しいタイプの高効率の糖転移酵素を発見するために使用することができます。(2)大腸菌等の微生物細胞において、合成生物学技術を用いてグルコースからreb dおよびreb mを合成する経路を構築し、関連する代謝ネットワークの制御、遺伝子制御要素の開発・最適化等によりreb dおよびreb mの収量を向上させ、収量を増加させる^ a b c d e f g h ie f g h i mで(3)ステビオシドの生産コストを削減するための固定化技術、全細胞触媒技術、多酵素カスケード技術、補酵素再生技術を開発し、市場投入を加速する。

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