ヒアルロン酸の製造方法は何ですか?

ヒアルロン酸(ha)とも呼ばれますhyaluronan,大分子ムコ多糖類が広く動物とヒトの結合組織といくつかの細菌のカプセルにあります。1934年、メイヤーらは牛のガラスのようなユーモアからこの物質を初めて単離した。1970年代、balazsら[2]は、ニワトリやヒトの臍帯の櫛からヒアルロン酸を抽出し、眼科手術用の副粘弾性剤nif-hyaluronicacidを開発し、ヒアルロン酸の医療応用の先駆けとなった。1980年代初頭に高級スキンケア化粧品に使用され、需要が大幅に増加しました。1987年には、関節炎の治療薬としても販売され、近年では、薬物担体および組織工学材料として広く使用されています。ヒアルロン酸の化粧品や医薬品への応用に関する研究の継続的な発展により、ヒアルロン酸は重要な新しい生化学薬品として、国内外でますます認識されています。

1980年代、中国は分離、精製、調製プロセスと臨床の研究を開始したヒアルロン酸の応用。1990年代初頭、ヒアルロン酸製剤はすでに新薬として市場に出ており、製造方法も抽出から微生物発酵へと進化しました。発酵菌株の変異を誘導することにより、発酵原料、発酵条件、発酵プロセスが継続的に改善、最適化され、ヒアルロン酸の収率が劇的に向上しました。しかし、発酵ブロスの粘度は、ヒアルロン酸産生のさらなる増加を制限します。現在、発酵法の研究は、単に収量を追求する研究から、ヒアルロン酸の品質を追求する研究に焦点が移っており、代謝工学的操作の開発に良い機会を提供しています。同時に、新しく安全な遺伝子組み換え株が徐々に市場に参入してきています。

1ヒアルロン酸の性質と特徴

1。1ヒアルロン酸の構造と物理的および化学的性質

ヒアルロン酸は、直線状の多糖で構成されています2糖の繰り返し単位としてのn-アセチルグルコサミン(glcnac)とd-グルクロン酸(glcua)。分子量の親類で约10⁵~ 10⁷300に1万1000人に二糖类部門大型生物になる分子です電子顕微鏡で観察すると、ヒアルロン酸は直線状の一本鎖であることが確認できます。直線軸上の単糖間の水素結合により、ヒアルロン酸分子は空間的に剛直ならせん状の円柱形をしている。水酸基が多いため、カラム内部は親水性が強い。ヒアルロン酸は、溶液中の水に自分の重さの1000倍まで結合することができ、この水はらせん状の柱に固定されています。それは簡単には失われません[3]。gibbsら[4]は、ヒアルロン酸溶液は低濃度では主に粘度を示し、高濃度では主に弾性を示すことを発見した。

様々な物理的および化学的要因(酸性およびアルカリ度、超音波、紫外線、x線、ガンマ線、ヒアルロニダーゼなど)がこの分解を引き起こす可能性がありますヒアルロン酸macromoleculesこれにより粘度が低下します。ヒアルロン酸とその調製物の製造中は、高分子の特性を維持するために、分子鎖の分解を最小限に抑える必要があります。

1.2ヒアルロン酸の分布と生理学的効果

ヒアルロン酸は広く分布しています様々なヒトや動物の組織の間質組織に存在しますまた、streptococcusやpseudomonas aeruginosaなどの細菌のカプセルの主成分でもある。異なるソースから得られたヒアルロン酸は、異なる分子量を持っていますが、それらの間に種の違いはなく、ヒトと動物に抗原性はありません[s]。

ヒアルロン酸の生理的効果は、その存在する組織によって異なります。例えば、皮膚では保水剤として働き、滑液では主に関節を潤滑し、血管では主に浸透性を調節します。また、ヒアルロン酸相互作用cd44、rヒアルロン酸、フィブロネクチンなどの様々なタンパク質と結合し、血管新生、腫瘍形成、細胞運動、創傷治癒、細胞接着など多くの生理学的代謝過程に影響を及ぼす。

2. ヒアルロン酸の応用

2.1. 化粧品

ヒアルロン酸は物質ですそれは自然に皮膚にあります。外因性ヒアルロン酸は、皮膚内の内因性ヒアルロン酸を補完します。国際的な化粧品業界では、ヒアルロン酸は理想的な自然の保湿因子(nmf)として認められています。ヒアルロン酸を含む化粧品は、「バイオミメティック化粧品」や「第四世代化粧品」として国際的に認知されており、多くの国が競って研究開発を行っています。

2.2美容と健康製品

ヒアルロン酸しわを減らすために充填剤として皮膚に注入されます[6。ヒアルロン酸は美容と健康のための製品としても使用され、経口摂取後に消化器系を通じて吸収され、皮膚や他の組織におけるヒアルロン酸の合成を増加させます。

2.3医療用途におけるヒアルロン酸

2.3.1手術

^ のb c d e f g h「使用済み」眼科手術におけるヒアルロン酸眼内レンズ移植のためにそれが角膜内皮を保護し、また眼内レンズの支持構造による損傷から虹彩を保護することを発見しました。他の眼科手術では、ヒアルロン酸の使用は手術の成功率を高め、合併症を減らすことができます。特にヒアルロン酸は、粘性手術に理想的でユニークな素材です。ヒアルロン酸は、網膜剝離手術、開眼硝子体切除術、傷ついた眼球の修復、角膜移植、緑内障手術において、さらに大きな効果が期待されています。

2.3.2関節疾患の治療

ヒアルロン酸とその塩(ヒアルロン酸)関節軟骨の滑液の主要な成分であり、関節の生理学的機能に重要な役割を果たしています。関節疾患が発生すると、関節内のヒアルロン酸の含有量が減少し、その物理的・化学的性質が変化します。外因性ヒアルロン酸の補充は、内因性ヒアルロン酸の増加を促進し、滑膜液の潤滑機能を回復し、軟骨の修復を促進し、炎症性メディエーターの産生を減少させ、関節機能を改善することができます。ヒアルロン酸には明確な治療効果があり、変形性関節症や関節リウマチなどの関節疾患に対しても安全であり、応用の可能性が高いことが多くの臨床結果から示されています[8]。

2.3.3医学におけるアプリケーション

ヒアルロン酸薬物担体として使用され、徐放薬および薬物の経皮吸収を促進する機能を有する。ヒアルロン酸は分子量が大きいため、分子は相互作用し、溶液中でクロスリンクしてネットワークを形成します。このネットワークが薬剤分子に付着し、ヒアルロン酸ネットワークキャリアから薬剤がゆっくりと放出されます。体内での拡散速度が大幅に遅くなり、長期にわたる遅延効果が生じます。

ヒアルロン酸またはその誘導体を様々な治療薬と組み合わせて化合物を形成することで、体内のさまざまな病理部位に薬が留まり、その効果を発揮することで、薬の全身的な副作用を低減する技術です。

2.3.4創傷治癒の促進

後ヒアルロン酸成功した目の手術に使用されました,それはまた、他の外科的処置に使用されました。現在、ヒアルロン酸は心臓外科、産婦人科、小児泌尿器科、腹腔鏡手術、その他の外科手術で使用されています。粘弾性の高い生体材料として、術後の組織の接着を防ぎ、創傷治癒を促進します。

2.3.5疾患診断指標として

変化ヒアルロン酸の量ヒトの血液にも病気の診断のための指標として使用することができます,特定の疾患の診断を支援するために。肝硬変患者の血液中のヒアルロン酸の量は有意に増加することがわかっており[10]、肝移植後のヒアルロン酸レベルの増加は組織拒絶の初期徴候である。悪性腫瘍を患っている場合、ヒアルロン酸の量の変化は腫瘍細胞の浸潤と関連しています[1]。

2.3.6組織工学材料

ヒアルロン酸にも幅広い応用があります生体材料の分野での展望。現在、ヒアルロン酸を利用した人工皮膚や人工骨製品の開発に成功しており、神経や血管などの臓器の修復材料の研究にも大きな応用の可能性を示している[12]。ヒアルロン酸の適用範囲も絶えず拡大しています。

3ヒアルロン酸の準備

3.1動物組織抽出法

この方法は、使用される最も古い方法です生産ヒアルロン酸そして、鶏の櫛、人のへその緒、豚の皮、牛の眼ガラスなどを原料としています。動物組織から抽出されたヒアルロン酸は、多くの場合、タンパク質やその他の多糖類を含んでおり、抽出プロセスが複雑で、収率が低く、精製が難しく、コストが高く、製品の品質が悪い。また、抽出プロセス中のヒアルロン酸の分子量を減少させます[13]。また、cockscombsのような原料の限られた供給源は生産を制限します。現在、動物組織の抽出法は徐々に発酵法に置き換えられる傾向にあります。

3.2微生物発酵法

3.2.1ヒアルロン酸の連鎖球菌合成

報告された主な系統ヒアルロン酸の生産streptococcus pyogenes(グループa)とstreptococcus zooepidemicus(グループc)、streptococcus equiとstreptococcus equisimilisです。a群レンサ球菌は病原性が高く、大規模な発酵にはあまり使われない。グループc連鎖球菌は病原性が低く、微生物発酵によく用いられる。最近の研究で、自然界には2種類のヒアルロン酸合成酵素(ヒアルロン酸syntヒアルロナナーゼ、ヒアルロン酸s)があることが示された。streptococciシンターゼ、タイプI脊椎動物はhyaluronanシンターゼは第二種シンターゼはのは、Pasteurellaだけmultocida¹⁴]。i型シンターゼは一般的に生産過程で研究される。streptococcus ha 合成(has) operator (operator) ha sa、ha sb、ha scの3つの遺伝子から構成され、それぞれha合成酵素、udp-glucose dehydrogenase、udp-glucose pyrophosphorylaseをコードしている15]。streptococcusにおけるヒアルロン酸の特異的合成経路[16]を図1に示した。

3.2.2ヒアルロン酸生産株の選択

野生型streptococcus株は、主にストレプトリシンとヒアルロニダーゼを産生する。ストレプトリシンは赤血球を溶解させ、白血球を殺し、心臓を中毒させる効果がある;ヒアルロン酸と混合すると、それも減少しますヒアルロン酸の品質。ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸を分解し、その収率を低下させる。したがって、大規模生産においては、ヒアルロン酸の品質と収率を向上させるために、まず突然変異を起こして溶血素とヒアルロニダーゼの欠陥株を得ることが一般的である。変異誘発法には、物理的変異誘発法[17]、化学的変異誘発法[18]、複合変異誘発法[19]がある。

3.2.3ヒアルロン酸発酵条件の最適化

レンサ球菌は栄養要件を要求しています。血清、脳の心臓注入および他の媒体は、通常、良好な成長のために必要です。しかし、これらの栄養素は高価であり、大量生産するにはコストが高すぎます。そのため、ペプトン、酵母エキス、牛肉エキスなどの複雑な窒素源が通常代わりに使用されます。炭素源は主に様々な単糖であり、最も一般的に使用されるのはブドウ糖である。その他の栄養素には無機塩や微量元素が含まれる。異なる菌株のために培地を最適化すると、培地が増加する可能性がありますヒアルロン酸の収量ある程度まで[20,21]。

ストレプトコッカス属は、好気性と嫌気性の両方の条件下でヒアルロン酸の生育と合成が可能な通性的嫌気性菌であるが、曝気発酵によってより高い収率と生成物の変換率を得ることができる。発酵培養液中の溶存酸素は曝気速度と攪拌速度を上げることで増加させることができますが、速度が高すぎるとヒアルロン酸の機械的分解を引き起こす可能性があります。

ph値は重要な要素であるヒアルロン酸の発酵。一般的には約7.0で制御されています。細菌はph 5.5以下または8.5以上では増殖できない。レンサ球菌は乳酸菌で、乳酸や酢酸などの小さな有機酸を生産する。発酵工程では、ph値をアルカリで中和して適切なph値に保つ必要があります。

発酵温度は一般的に37°cであるが、35°cや33°cといったより低い温度を使用したり、段階によって異なる温度を使用したりすることもある。種子の培養段階と発酵の初期段階では、37°cの培養は細菌の成長と増殖をより速くすることができます。発酵の中期と後期では、温度を適切に下げることができます。これにより、グルコースの代謝が細菌の細胞壁合成からヒアルロン酸合成へと移行し、増加することが報告されているヒアルロン酸の収量[2]。

水保持ヒアルロン酸の能力分子量と正の相関があり、分子量が大きいほど保水力が高くなります。したがって、分子量もヒアルロン酸の品質を評価する上で重要な要素です。armstrong[23]らは、曝気を適切に増やし、発酵温度を下げることが、ヒアルロン酸の分子量を増やすことに役立つことを発見した。最初のグルコース濃度は、ヒアルロン酸の分子量に大きな影響を与えます。さらに、発酵過程でグルコサミン、ピルビン酸、ウラシルなどを添加することも、ヒアルロン酸合成の前駆体であるヒアルロン酸の産生を増加させるのに役立ち、それらを添加することで高分子量ヒアルロン酸を得ることができる[24]。

発酵ブロスは曝気下で一定量のフリーラジカルを蓄積することがある。フリーラジカルはヒアルロン酸の分解を引き起こす可能性があります。バニル酸のような遊離ラジカルのスカベンジャーを加えるとサリチル酸、タンニン酸などは、発酵のブイヨンにある程度ヒアルロン酸を保護して、ヒアルロン酸の相対分子量を増加させることができます。発酵ブロスに少量のリゾチームを加えることも、ヒアルロン酸の収率を高めることができます。Lysozyme&#細菌が自分自身を保護するために、より多くのヒアルロン酸を分泌する必要があるように、39の機能は、細菌の細胞壁を破壊することです。sdsのような特定の界面活性剤を添加するとヒアルロニダーゼが不活性化され、それによってヒアルロン酸の収率と相対分子量が増加する。

3.2.4ヒアルロン酸発酵プロセス研究

ヒアルロン酸solutionは典型的な非ニュートン的ケソン流体です攪拌速度とヒアルロン酸濃度は気-液体酸素移動速度に大きな影響を与える;より高い攪拌速度での発酵は、より高いヒアルロン酸収率を得ることができます25]。そして、グリッドパドルミキサーリアクターの使用は、タービンミキサーよりも優れた混合効果を提供し、より高いヒアルロン酸収率をもたらす[26]。

発酵の後期では、細菌の成長が静止期に入ると、細胞は毒素と分解酵素を生成し始める。酵素は細菌の自己分解を引き起こし、細胞成分が培地に放出されるため、抽出が困難になります。安定した組成の培地中でヒアルロン酸を連続培養する連続培養法を用いると、これらの酵素の発現を減少させ、細胞壁の再生速度を低下させることができ、分離と精製に有益である[27]。しかし、ヒアルロン酸収益率連続発酵中に不安定になることが多い。【28】表にらは余白方法は、定期的で薄めダシ発酵、希釈の複数を増やすことなど0.4h⁴、ヒアルロン酸意識を高めるまいった25%とまいった横ばいだった。

3.2.5ヒアルロン酸代謝工学に関する研究

 代謝工学は、微生物の性能を改善し、最終製品の歩留まりを向上させるための代謝経路の修飾を研究する新しい分野です。微生物株の改良に広く使用されています。研究者は、ストレプトコッカスによるヒアルロン酸産生の代謝経路を研究し、理論的に最大であることを発見しましたヒアルロン酸の変換率0.84 g/gを超えていますが、製造中のヒアルロン酸の変換速度はわずか0.1 g/gであり、炭素源のほとんどは乳酸や酢酸などの小分子酸に変換されます。何人かの研究者は、分子生物学的手法を用いて、ストレプトコッカス酸ストレプトコッカスのヒアルロン酸代謝ネットワークのキーノードを制御し、熱力学の許す範囲内でヒアルロン酸の収量と収量係数を有意に増加させようとしている。

chong[16,29]らは、str . zooepidemicusのエネルギー代謝がnadhオキシダーゼの活性によって調節されていることを発見した。彼らはnadhオキシダーゼの遺伝子をクローニングし、細胞内で過剰発現させた。nadhオキシダーゼの活性が高まるにつれて、グルコース発酵の主産物も乳酸から酢酸に変化し、その結果、細菌のバイオマスが著しく増加した。発酵の後期には、生成されたヒアルロン酸が細胞を包み、発酵スープの粘度を高め、溶存酸素を減少させ、細胞の成長とヒアルロン酸産生を制限します。haoningら[30]は、透明なtremella (vitreoscilla sp.)のヘモグロビン遺伝子(vgb)をレンサ球菌に導入し、この細菌による酸素利用を有意に改善し、細菌の増殖を促進し、その産生を増加させた約20%ヒアルロン酸。レンサ球菌は発酵中に過剰な乳酸を生成し、大量の炭素源を消費するだけでなく、発酵液のphを低下させて菌の増殖を阻害する。

wu³たちは、ポリヒドロキシ酪酸(phb)合成酵素系遺伝子phbcabをs. zooepidemicusに導入し、iptg誘導下でphbcab遺伝子を発現させて新しいnad再生経路を得た。これによりnadhの蓄積を回避し、乳酸合成を減少させた。同時に、nadはヒアルロン酸合成に必要であり、それはヒアルロン酸合成を促進する。シェイクフラスコ中のヒアルロン酸の収率は29%増加した。krahulec³]らは、bグルクロニダーゼ欠損株のヒアルロン酸収率が野生型より20%高く、分子量も2%増加したことを発見した。これは、b-グルクロニダーゼが遊離したb-グルクロン酸を非還元末端から加水分解できるためであると推測されている多糖類そして遊離したb-グルクロン酸はそのオペロンの発現を誘導し、培地中の豊富なグルコースを浪費する。

3.2.6遺伝子組み換え菌株を用いたヒアルロン酸生産に関する研究

野生型のa群およびc群レンサ球菌は、ヒトおよび動物に病原性を示す溶血素を産生する。非病原性の変異株を選択して大量生産するが、発酵中の溶血素は無視できない。レンサ球菌発酵培地は高価ですそのため、新しいgras(一般的に安全と認識されている)に改変された菌株の建設が研究の焦点となっている。

yuらは[33]ヒアルロン酸合成酵素をコードするs . zooepidemicusのssea遺伝子を人工的に合成し、streptococcus ヒアルロン酸sbまたはヒアルロン酸sb +の相同遺伝子とともに大腸菌に移植したヒアルロン酸sC。、大腸菌组换え株を得るために190 0.0469 mg / lヒアルロン酸の生成とmg / l 160 mg / lそれぞれ平均分子量3.5×10⁵190×10⁶で競り落とされた。novozymesは枯草菌bacillus subtilisにs. equismilisヒアルロン酸遺伝子を導入した。ヒアルロン酸合成経路の重要なステップを操作することにより、遺伝子発現を最大化し、ヒアルロン酸産生を増加させ、その分子量を制御することができます。遺伝子発現を誘導するために特定の物質を使用する必要はなく、それが分泌するヒアルロン酸は収率が高く、回復しやすい。

chienらは、連鎖状球菌等身subspのヒアルロン酸saとヒアルロン酸sb遺伝子を挿入した[34]。lactococcus lactisのnice (nisin-controlled expressiにsystem)へ遊離し、lactococcus lactisではヒアルロン酸saとヒアルロン酸sbが共発現し、ヒアルロン酸生産量は0.65 g/lに達します。さらに、緑藻細胞にクロレラウイルスを感染させ、ヒアルロン酸合成システムを開発する人もいます。これらの新しい遺伝子組み換え菌株はヒアルロン酸れていたもののを持たない面で競合優勢の机械刈取ことも潜在の分子量ヒアルロン酸はコントロールできます。純度は節制しやすいという点でだんだん菌株発生しない毒素が害をや生き物もhyaluronidaseを作り出しますしたがって、生産に適しています良質のヒアルロン酸.

3.3 でvitro合成法

研究は、生物では、ヒアルロン酸が合成されることを示していますヒアルロン酸シンターゼudp-glcuaとudp-glcnacの合成を触媒する。そこで近年、ヒアルロン酸を酵素法ででvitroで合成しようとする研究者が現れ、研究が進展している。霊Minらだ。[35増幅hyaluronanシンターゼの遺伝子も(sqHyal) Str.等身、造営表情plasmid pSE-sqHyal大腸菌な形にDH5α。誘導および培養後、細胞膜からsqhyalタンパク質と活性が検出された。細胞膜を持ち歩いている酵素を、UDP-GlcUA UDP-GleNAc基板として使用され、synthesiseヒアルロン酸3.6ととても分子量の×10体外で⁶しますこれは、発酵法と抽出法でそれぞれ生成されるヒアルロン酸の約2.5倍と5倍の分子量です。

京都大学の小林史郎教授は、天然の酵素重合反応によってヒアルロン酸を人工的に合成しました。の忘年会に向け、論文を発表する日本化学会、小林四郎教授は、合成作り方ヒアルロン酸にまずsynthesiseヒアルロン酸oxazolidine派生多糖高分子を用いてを加えて、hyaluronidase酵素を午後は俺を酵素複素派生ユニット及びを創造する事です最後に、90°c反応溶液から酵素が除去され、ヒアルロン酸が生成されます。の合成ヒアルロン酸でvitroで製造されたヒアルロン酸は、天然で製造されたヒアルロン酸と根本的な違いはありませんが、その構造はそれほど純粋ではなく、現在は研究開発段階にあります。

4結論

のヒアルロン酸の世界的な需要毎年増え続けています組織抽出法は比較的成熟していますが、ヒトや動物の結合組織からヒアルロン酸を単独で抽出するだけでは、市場の需要に応えることは困難です。発酵によるヒアルロン酸の生産コストは抽出に比べて大幅に削減され、収量と分子量も改善されていますが、変換効率は依然として非常に低いです。代謝工学的手法を用いることで、ストレプトコッカスによるヒアルロン酸産生の代謝経路におけるキーノードは、ストレプトコッカスによるヒアルロン酸産生の代謝経路に応じて調整することができる。ヒアルロン酸の収率と分子量を、熱力学的に許容される範囲内で大幅に増加させることが可能です。あるいは、遺伝子工学的手法を用いてこの菌株を改変し、新しい微生物の内外でヒアルロン酸を合成することで、生産コストを削減し、ヒアルロン酸の収量と品質を向上させることができます。分子生物学技術の持続的な発展に伴い、これは新しい発展の方向になります。

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