フェルル酸から天然バニリンを得る方法?

あらすじ:Vanillin is the third largest edible spice in the world, and with the improvement of people'の健康意識、天然バニリンの投与量は年々増加しています。本研究では、streptomyces psammoticus omk-4をバニリン製造用発酵菌として用い、醗酵条件をマッピングし、30 l自動補充発酵機で最適化した。培養液量、培養温度、培養ph、溶存酸素などの発酵条件を最適化して最適な発酵条件を決定し、有効性は25.3 g/ lと高かった。その結果は以下の通りであった。

バニリンは、科学的には4-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドとして知られており、ペルーのバルサム、クローブ油、バニラ、コーヒー、ブドウ、ブランデーに含まれており、バニラ臭と甘い味を持っています[1-3]。バニリンは、食品、タバコ、化粧品、農業において、香り増強剤、香料剤、調和剤、アロマブースターとして使用できる重要なフレーバーです。  バニリンの用途は多岐にわたるため、年間の需要は10%の伸びを示していますが、国内生産ではまだ国内外の需要を満たすには至っていません[4-5]。

バニリンは化学合成、抽出、生合成および酵素法によって製造することができる[6]。people&の増加に伴い#39;の健康意識は、天然バニリンの需要と価格が継続的に上昇しており、それは近年ホットな研究課題となっている[7]。しかし、植物から抽出される限られた量の天然バニリンは、市場の需要を満たすことはできず、化学合成による環境負荷がますます重くなっているため、バイオ変換と酵素法がバニリンの生産の主な力となっている[8-9]。

This paper adopts the bioconversion method to produce vanillin through microbial metabolismサイクルが短く、収率が高く、汚染の少ないフェルル酸を基材とし、発酵条件を最適化すれば、工業化に向けた条件が整います。

1材料・方法

1.1実験株

streptomyces psammoticus omk-4をxiamen omicron biotechnology co。

120主な楽器

30 l自動補充発酵機、上海宝興生物有限公司;高性能液体クロマトグラフ(HPLC)、,inc . 1260Ⅱ;山東科学院生物センサー、sba-40e;分光カメラは、岛津、UV-1780;ph計、メトラー・トレド、s-210s。

1.3培地

1.3.1シードメディア

水溶性澱粉1.0~3.5 g/ l、リン酸二水素カリウム0.1~0.5 g/ l、尿素0.1~0.3 g/ l、硫酸マグネシウム0.05~0.10 g/ l、炭酸カルシウム0.1~0.3 g/ l、酵母浸出粉0.1~1.0 g/ l、コーンシロップ0.1~1.0 g/ l、硫酸アンモニウム0.1~0.6 g/ l、フェルル酸0.2 g/ l。

1.3.2発酵メディア

水溶性澱粉2.0~5.0 g/ l、リン酸二水素カリウム0.1~0.3 g/ l、尿素0.1~0.5 g/ l、硫酸マグネシウム0.05~0.1 g/ l、炭酸カルシウム0.5~2.0 g/ l、酵母エキス0.1~1.0 g/ l、硫酸アンモニウム0.1~0.5 g/ l、アビック酸2.0 g/ l。以下は、サンプルの調製に使用された可溶性デンプンの例です。

1.4栽培方法

1.4.1シード文化

接种、無菌条件下ヘラの着うたフルを挿入するためwell-grownから細菌株を養殖固体無菌シード媒体が斜めに降っての初期pH番シードの媒体は、5 ~ 8,しますが行われた生物対数「先端技術条件下の成長期に孵化温度28 ~ 35℃回転速度200 ~ 500 r / min ?。

1.4.2 Fermenter文化

対数成長段階まで培養した種子液を、無菌条件下で5 ~15%の容積で発酵液に添加する。初期のpH発酵媒体は、7.2 ~ 7.8発酵がおこなわれ「先端技術条件下の70 ~ 120 h 30兆~ 40℃の温度、かく、時速200 ~ 500 r / minと通気性率1︰0.5。発酵させることが条件のもとで行われだった1︰0.5「先端技術条件下の発酵が行なわれ1︰0.5。

1.5発酵条件の最適化

1.5.1バニリン発酵に対するphの影響

発酵プロセスのphは基質の存在に影響を与えるだけでなく、細胞の浸透圧と相関し、基質の細胞への出入りに影響を与えます。最適な発酵phを得るために、異なるph制御のバニリンの効力に対する影響を調査した。具体的な方法は以下の通りである。(1)発酵プロセス全体のphを7.5に制御した。(2)発酵過程のphを0 ~ 12時間7.5、その後の発酵過程のphを8.0とした。

(3)発酵過程を通じてphを8.0に制御した。

1.5.2バニリン発酵に対する溶存酸素の影響

培養液中の溶存酸素の制御は、後期の菌の増殖や生成物の蓄積に大きな影響を与えることが実験で示されており、発酵過程における溶存酸素の制御が必要である。発酵中の溶存酸素を最適に制御するために、異なる溶存酸素制御が細菌の増殖および生成物の蓄積に及ぼす影響を調べました。溶存酸素を回転速度で0%,10%,20%,30%,40%,50%制御する実験を行った。

1.5.3バニリン発酵に対するインキュベーション温度の影響

温度は、微生物の生産、代謝物の合成および蓄積に重要な影響を及ぼします。温度が上昇すると、微生物の成長と代謝を促進することができますが、あまりにも高温になると、生物の早期衰退につながり、生成物の蓄積に影響を与える可能性があります。そのため、ひずみの温度を最適化することが重要です[10]。最適な発酵文化の温度を得るために、温暖化のその効果を調べ異文化との細菌がその遺伝コードを新成長論の成長バクテリアと比較vanillinの蓄積気温25℃を操作することで30℃、35℃40℃を受けることが、最適な体温制御方法に関する。 

1.5.4バニリン発酵に対する接種量の影響

異なるinoculum量は正常へ大きな影響は細菌がその遺伝コードをの成长代謝少なすぎるinoculumの伸びが鈍化を招くと細菌の成長を後押しする遅延期間の細菌が長くなるでしょうとばの複雑さの副老廃物は役立たない积もる後に至っている。あまりにも多くの接種は、細菌の過剰成長をもたらし、用土は栄養素の枯渇を増加させ、溶存酸素は制御要件を満たすことができなくなります[11]。したがって、接種菌の発酵量を制御することが重要です。最適な発酵inoculumレベルを得るために異なるinoculumレベルの効果を菌の繁殖を調査したが、菌の繁殖と蓄積vanillinを比較した階層の5勾配のinoculumさ1% 3% 5%台を取得し7% 9%、inoculumレベルの最适化。

1.6分析の方法

細菌濃度の測定培養液を蒸留水で一定回数希釈し、よく混ぜ、分光光度計を用いて620nmの吸光度を測定する。

残留糖の決定:フェリン's試薬滴定法を用いた[12]。Determination of vanillin content: HPLC [13].

2結果と討論

2.1バニリン発酵に対するphの影響

図1に示すように、細菌の増殖はph 7.5で良好で、最大od620は0.62であった。細菌の増殖はph 8.0で悪化し、最大od620は0.41であった。細菌の増殖は0-12時間ph 7.5で良好であり、その後のコントロールで8.0で最大od620 0.64であった。そのため、ph 7.5で菌の増殖が促進され、phが高いと菌の増殖が遅くなります。phが高いほど、細菌の成長は遅くなります。分割ph制御を見ると、後期にphを8.0に調整しても菌の生育に影響はなく、醗酵12時間程度ではほぼ安定化していたことがわかる。

【図2から分かるようにvanillin濃度13.200 g / L, 16.988 g / L、14.500 g / L別のpH制御でvanillin変換率は史上最高のh 12時pH 7.5 0から、それからpH値の8.0、続いてpH 8.0 pH 7.5で貧しいれた原因になるだろうが酵素が働きはpH時よりpH 7.5 8.0たわこれは、ph 8.0での酵素活性がph 7.5よりも優れていたためと考えられます。

図1と図2を合わせると、ph 7.5では菌の増殖が良く、ph 8.0では酵素変換率が高いことがわかります。そこで、発酵中の分割制御が菌の成長を助け、より良い酵素活性を得ることが選択されました。

2.2バニリン発酵に対する溶存酸素の影響

図3からわかるように、溶存酸素の増加に伴って細菌の濃度が増加しており、その中で細菌の増殖が最も悪いのは溶存酸素の0%で、ほとんど細菌は増殖していない。溶存酸素の40%~50%では,細菌の生育に最適な条件であり,細菌の生育が最も高く,od620は0.75であった。増えている溶存酸素の場合中に入る頃細菌を対数成長期が減り、溶存酸素が45 ~ 50%以上時適応期間の成长のバクテリアは最短と細菌は早く対数成長期に入ることができる状態がこれにより短縮発酵サイクル。したがって、菌の増殖には多量の酸素供給が必要であり、溶存酸素が40%~50%のときに菌の増殖が最適と判断できます。

From Fig. 4, it can be seen that the accumulation of vanillin 粉 showed a gradual increase and then a slow decrease with the increase of dissolved oxygen, and the best accumulation of vanillin was found at about 30% of dissolved oxygen, and the highest accumulation was about 17.5 g/L. The low accumulation of vanillin at low dissolved oxygen might be due to the poor production of the bacteria, the insufficient enzyme or the low dissolved oxygen condition affecting the enzyme vitality. With the gradual increase of dissolved oxygen, the accumulation of vanillin gradually showed a decreasing trend, especially at 50% of dissolved oxygen, the decrease of vanillin occurred in the late stage of fermentation, and it was found that the accumulation of vanillic acid as a by-product gradually increased, which was suspected to be due to the excessive dissolved oxygen that led to the metabolism flow biased towards the production of vanillic acid. It is suspected that the dissolved oxygen level is too high, which leads to the bias of the metabolic flow towards vanillin production. Therefore, the dissolved oxygen level should not be too high in the vanillin production stage to avoid affecting the overall conversion rate.

から分かるように図3および図4の制御発酵時の、溶存酸素が选ばれ、段階的に制御する、溶存酸素が遠隔地から45 ~ 50%以上確保する繁殖する段階に巻の蓄積によりバクテリアと成長サイクルを短縮するを作る際に、溶存酸素は制御30%で停止vanillinの段阶に生产を確保するために快速蓄積を配賦する。

2.3バニリン発酵に対するインキュベーション温度の影響

【図5から見られる成長の細菌が遅れていたが気温が低く、それに細菌の濃度)は高く通信容量の増大に伴い抱卵温度、育細菌の濃度値は最高気温が約35℃で、上るとOD620 0.73;しかし、温度が40℃に上がると細菌の濃度が低下し始めたが、これは高温による細菌の正常な代謝が破壊されたためと考えられる。

温度が上がるにつれてバニリンの換算率は高くなり、35℃、30℃、40℃、25℃の順になる。各細菌の換算率を計算すると、最適温度は40℃、35℃、30℃、25℃の順である。最適温度は40℃、35℃、30℃、25℃。温度が上がるにつれてバニリンの変換率は高くなり、より高い温度でのバニリンの変換率はより低い温度でのバニリンの変換率よりも良好であったことがわかる。

図5と図6を比較すると、omk-4株の発酵とバニリン変換に対する温度の影響が大きく、菌株の培養とバニリン変換には35℃が選択されていることがわかる。

2.4バニリン発酵に対する接種量の影響

図7から、最終的な細菌の濃度に異なる接種剤の量の影響を見ることができ、5つの異なる接種剤の量は約0.7の濃度に達することができ、そのうち1%の接種剤の濃度が悪化し、最高濃度は約0.65です。  最初の10 h、緊張が、量を増やす発酵の遅延期間は明らかに短縮1%、9%比較と遅延期間は目覚ましく約6 h短縮、【図8から分かるように9% inoculumのinoculumの1%より有効だと思うんです【図8から分かるようにinoculum 9%量他の4は目覚ましくよりinoculum金額、事実のせいだと思い、細菌が過程を中心にで供給される栽培と生命力の酵素が増えるのに伴って縮小しなければならない濃度はバクテリアの先手を取ろうとしますしたがって、接種の過程で接種量が大きすぎるべきではありません。接種量の1%、3%、5%、7%を比較すると、バニリンの換算率は他の4つの接種量よりもわずかに高く、最も高い換算量は17.21 g/ l、17.23 g/ l、18.05 g/ l、17.27 g/ lであった。図7と図8の結果を考慮して、最終的に最適な接種量5%を選択した。

3結論

30 l自動充電発酵機を最適化して得られた最適発酵条件は,ph 7.5,溶存酸素40 ~50%,ph 8.0,溶存酸素30%であった。発酵温度は35℃、接種率は5%であった。発酵温度は35℃、接種量は5%であった。最適な条件で36時間発酵させ、バニリンの最終的な効力は25.3 g/ lと高く、パイロット実験の結果は良好であった。

参照:

[1] ou shiyi, li aijun, bao huiyan, et al。バニリンの生物生産の進展[j]。広州食品工業科学技術,2000,20(2):119-121。

【2】翠珠王。安全、健康、おいしい、より良いバニリン製品とソリューションを作る——アジア太平洋地域総経理の劉洋氏とソルベー香料と機能化学品事業部グローバル戦略とマーケティング部長の黄浩波氏にインタビュー[j]。日本食品安全学会誌,2019,238(13):28-30。

【3】楊文文香料の女王、天然バニリンの生合成の進展[j]微生物学公報」を発表した。2013年、40(6):1087-1095。

[4]ファンy .バニリン製造のための基質としてのフェルル酸の微生物変換の研究[j]。穀物・食品産業、2017年、24(6):43-47。

【5】徐従武中国バニリン輸出の収益性向上対策[j]。日刊赤峰大学(自然科学版)2014年(2):82-84。

[6] zhen da, wu xiaogang, deng bei, et al。バニリンの微生物合成の応用[j]。^ a b c d e f g h i『食の研究』、2012年、143 -149頁。

【7】呂暁傑バニリン産業の発展状況[j]。2019年現代的な食品7(5):14。

【8】張建斌。バニリン調製技術の研究進捗と展望[j]。2018年(平成30年):163-166。

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[10] nida k, aamer a s, sadia q .下水汚泥から分離されたbacillus sp. strain s10によるタイヤゴムの劣化に対するphおよび温度の最適化[j]. . international biodegradation &Biodegradati、2015年(9)3)11月30 154-160。

[11] wang haopeng, yang meng, wu liming, et al。発酵条件の最適化とフモニシン5 lタンクのパイロット試験[j]。2019年中国醸造38(2):98-103。

[12] zhang shengzhen, ma yanzhi。りんごの総糖度を決定する方法の比較[j]。^ a b c d e f g h『日本経済史』第2巻、259-260頁。

【13】黄玉環、劉洪州、虞瑞辰。高性能液体クロマトグラフィーによるバニリンの定量[j]。^岩波書店、1998年、27(2):17-20頁。