q10酵素の作り方

コエンザイムQ10,an important hydrogen transporter in the respiratory chain of living cells, is widely found in animals, plants and microorganisms. Coenzyme Q10 was first isolated from the mitochondria of bovine hearts by Frederick crane of Wisconsin, USA, in 1957; in the same year, Morton of the UK obtained the same compound from the livers of vitamin A-deficient rats and named it coenzyme Q10; and in 1958 karl Folkers of Merck Inc. determined its structure and chemically synthesized it for the first time.

1958年、merck inc .のkarl folkersがその構造を決定し、初めて補酵素q10を化学的に合成した。日本では1977年に微生物発酵によるコエンザイムq10の製造が工業化された。1978年、ピーター・ミッチェルは、エネルギー変換系における補酵素q10の重要なプロトン移動の役割を説明する化学浸透理論を用いてノーベル賞を受賞した[1]。

現在、コエンザイムq10の主な生産方法には、植物と動物の組織抽出、植物と動物の組織培養、微生物発酵、化学合成が含まれます。他の方法と比較して、微生物発酵は高い製品活性、低い原料コスト、容易な制御、大規模生産を特徴とします[2]。

コエンザイムq10の医学的価値と臨床応用に関する広範な研究により、心臓病、糖尿病、がん、急性・慢性肝炎、パーキンソン病などの様々な疾患の治療に広く使用されています#39; sですまた、タンパク質の過酸化を遮断する能力を持っています。コエンジェムq10は、酸素ラジカルの除去剤として、健康や美容にも広く使用されています[3-4]。

1コエンザイムq10生合成経路

1 .1つの構造と前駆体

コエンザイムq10はキノン化合物である。その構造を図1に示します。その構造から、2,3-ジメトキシ- 5-メチルベンゾキノンを核とし、ポリ(2-メチルブテン(2)ベース)側鎖が付いていることがわかる[5]。

キノン核の前駆体であるp-ヒドロキシ安息香酸は、細菌と高等真核生物でそれぞれ分岐酸とチロシンを前駆体として合成されるが、酵母では両方の物質をp-ヒドロキシ安息香酸の前駆体として合成することができる。酵母では、どちらの物質もp-ヒドロキシ安息香酸の合成の前駆体として用いられる。ポリ(2-メチルブテン)-ブチレン(2)ベースの側鎖の合成は、ジメチルプロピルピロリン酸(dmapp)とイソペンテニルピロリン酸(ipp)という2つの異性体前駆体に基づいている[6]。

図1コエンザイムq10の構造

1 .2 .芳香環合成経路

1 .2 .1 p-ヒドロキシ安息香酸の生合成

The synthesis of PHB, an important precursor in the aromatic ring synthesis pathway of coenzyme Q10大きな関心を集めてきましたメガナタンはeからのphbの合成を研究した。大腸菌とs. cerevisaの変異体ですmeganathanは、大腸菌とs . cerevisaの2つの変異株、ubiとcoqにおいて、補酵素q10の合成経路を研究し、これらの変異株の生体内での芳香環合成経路がわずかに異なることを発見した。E大腸菌は、ubic遺伝子にコードされている分岐酸切断酵素を用いて、植物や微生物に広く見られる、糖から芳香族アミノ酸への代謝経路であるマンギフェロール酸経路を切断し、phbを生成する。一方、s . cerevisa変異体にコードされた分岐酸切断酵素を用いることで、分岐酸を切断してphbを生成することができる。cerevisaは分岐酸の切断に加え、チロシンの一連の脱アミノ化、アシル化、および脱アシル化によってもphbを得ることができる[7]。

1 .2 .2芳香環修飾 

Meganathan' sの研究結果も合成経路からPHBは合計7の酵素8-step反応を示し(図2参照)PHB-poly-2-methylbutene (2) -yltransferaseでもどこでもa / coq 2は、符号化されpoly-2-methylbutene (2) -yl側、芳香指輪への连锁具体的な酵素強い基板と。代謝経路は生物によって異なる。

S。cerevisa、水酸化、メチル化、脱炭酸が起こるが、大腸菌では脱炭酸、水酸化、メチル化が先に起こり、メチル化が続く。cerevisaでは水酸化、メチル化、脱炭酸が起こるのに対し、大腸菌では脱炭酸、水酸化、メチル化が起こる。合成経路では、o- transmethylasesはubi g /coq 3、c -transmethylasesはubi e /coq 5、デカルボキシラーゼはubid / ubix、モノオキシゲナーゼはubibおよびubi e /coq 5にそれぞれコードされている。コエンザイムq10を合成する植物と動物の遺伝子の報告の中には、これらの遺伝子の全てが相同遺伝子として植物と動物の遺伝子に存在するものもある。しかし、同じモノオキシゲナーゼをコードするubiのf /coq 7遺伝子は、植物や動物の遺伝子からはまだ見つかっていない[8]。

図2 e。大腸菌とscereuisiae in vivo補酵素q10芳香環合成経路[6]

1 .3 .ポリ(2-メチルブテン(2)ベースの側鎖の生合成経路

1 .3 .1Side-Chain前兆

3.1側鎖前駆体合成ポリ(2-メチルブテン(2)ベース)側鎖の合成には、酵母ではメバロン酸経路(mva)、細菌では2- c-メチル- d-エリトリトール4-リン酸経路(mep)を介して得られる2つの異性体前駆体dmappとippが必要である[9]。細菌のメチル- d-エリトリトール4-リン酸(mep)[9]。

1 .3 .1 .1 MVA経路 

真菌と酵母におけるippとdmappの合成を図3に示す。合成経路の最初の前駆体はアセチル補酵素aであり、これは最初に自身のエチル基および別のアセチル補酵素aのカルボメチル基と相互作用してビス(アセチル補酵素a)を形成し、続いて他の分子と結合して3-ヒドロキシ3-メチルグルタリル補酵素a (hmg-coa)を形成する。hmg-coaは2段階の還元反応を経てメバロン酸を形成する。メバロン酸は2段階のリン酸化によってメバロン酸ピロリン酸に変換される。メバロン酸ピロリン酸の脱水と脱炭酸を経てippが形成され、ippイソメラーゼによってippとdmappが交換される[10]。

1 .3 .1 .2 MEP経路 

細菌におけるippとdmappの合成の開始前駆体は、解糖系の2つの中間生成物であるプロピオン酸と3-リン酸- d-グリセルアルデヒドに由来する。まず、プロピオン酸の脱炭酸生成物がd-ホスホ- d-グリセルアルデヒドと結合し、ispのd-遺伝子にコードされたd-キシログルサン合成酵素の作用により、5-ホスホ1 -デオキシキシ化キシログルカン(dxp)を形成する。dxpはさらにmepに還元され、ispのd遺伝子にコードされている2-メチル- 4-シチジンジリン- d-エリトリトール合成酵素の作用により1分子のctpと結合して2-メチル- 4-シチジンジリン- d-エリトリトールを形成する。この物質はさらにリン酸化され、2-メチル-4-シチジン二リン酸- d-エリトリトールが生成する。

isp fにコードされている2-メチル- d-エリトリトール-2,4-環状ピロリン酸シンターゼの存在下で、2-メチル-2-リン酸-4-シチジン二リン酸- d-エリトリトール分子はcmpの1分子から2-メチル- d-エリトリトール-2,4-環状ピロリン酸に分解される。ippおよびdmappへの環状ピロリン酸の代謝に関与する酵素および遺伝子は、さらなる研究が必要である。ippとdmappは、ippアイソザイムをコードするidi遺伝子の作用によって変異している[11]。

図3真菌と酵母のエンドソーム側鎖前駆体合成経路[10]

1 .3 .2 Side-chain合成

側鎖生合成経路(図5参照)では、プライマーdmappが最初にgppシンターゼによってippと合成され、c10グルココルチコイド二リン酸(gpp)が合成される。gppとippの1分子はfppシンターゼによって触媒され、c15ファルネシルピロリン酸(fpp)を合成する。fppはippと結合してggppシンテターゼを介してc20ゲラニルゲラニルピロリン酸(ggpp)を形成する。その後、一連のイソペンテニルピロリン酸合成酵素によって一連の補酵素qの側鎖が合成される[12]。

補酵素qシリーズの側鎖長は通常c25よりも長いが、c25より短い側鎖は自然の補酵素qシリーズの側鎖長となることは稀である。kainousは、fppシンテターゼとggppシンテターゼには2つのアスパラギン酸リッチ領域があり、最初の領域の5位のアスパラギン酸が側鎖の長さに重要な役割を果たしており、異なる起源の前駆体が側鎖の長さに一定の影響を与えていることを発見した。異なるソースからの前駆体は、サイドチェーンの長さに一定の影響を与えます。E大腸菌はisp aおよびisp b遺伝子にコードされている一連のイソペンテニル二リン酸合成酵素を介して、mep経路で得られた前駆体をq7からq10までの一連の側鎖に合成することができる。S。cereui-saはmva経路の前駆体をq5からq10までの一連の側鎖に合成することができる[13]。

略称は5 e。大腸菌とscerevisiae E大腸菌とscerevisiae in vivoの補酵素q10側鎖合成経路[7]図5経路f0r bi0synthesis 0f p0lyprenyl diph0sphate in e。大腸菌とs大腸菌とscerevisiae s cerevisiae

2コエンザイムq10発酵プロセスの最適化

2 .生産の第1株ライン

現在、coq10株の報告数は主にpseudomonas、saccharomyces、photosynthesizing bacteria、paracoccidioidesなどに集中している。微生物におけるcoq10の分布は不均一である。微生物における補酵素q10の分布は一様ではなく、グラム陽性菌のように酸素呼吸を必要としない細胞では生産性が低く、グラム陰性細胞では比較的多く生産される。近年、生体内でのコエンザイムq10の合成経路のさらなる解明や、酵素工学や遺伝子工学の応用により、遺伝子組み換え細菌株によるコエンザイムq10の合成が報告されている。y0shida[14]では、rhodococcus globulus変異株の変異原化と合理化スクリーニングによりau-55変異株を得、shake flask発酵培養により最高180 mg/ lの収量を得た。

2 .2培地組成の最適化

2 .2 .1炭素筋 

補酵素q10の合成にはポリ-2-メチルブテン(2)を基とした側鎖が必要である。tanakaら[13]は、シェイクフラスコを用いてc株を培養した。T . [13]は、c10 ~ c13炭化水素を炭素源とするpk-233株のシェイクフラスコ培養法を用い、30℃で45時間培養した。コエンザイムq10は培養液から4.66 mg/ lの濃度で得られた。

2 .2。2窒素筋 

wu zufangら[15]は、発酵軟膏、ペプトン、コーンシロップ、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの異なる窒素源を用いて、shakeフラスコでrhizobium radiobacter wsh2601を発酵させたところ、無機窒素よりも有機窒素の方が有効であることを示した。窒素源として16 g/ lペプトンを使用すると、補酵素q10の合成が最大化された。

2 .2。3金属イオン 

aci(日本)の研究では、金属イオン、特にmg2 +、fe2 +、mn2 +がr .スファeroidesの発酵に有益な働きをし、補酵素q10を生成することが示された。sphaeroides発酵によりコエンザイムq10を生成する。培地に12.2 mm0l/ l mgso2 +とmn2 +を添加すると、補酵素q10の発酵が促進された。2 mm0l/ l mgso4, 1。12.2 mm0l/ l mgso4, 1.8 mm0l/ l feso4, 0.9 mm0l/ l mnso4培地に12.2 mm0l/ l mgso4, 1.8 mm0l/ l feso4, 0.9 mm0l/ l mnso4を添加すると、補酵素q10の生産量が2.0 mg/gから8.0 mg/gに増加した。0 mg/gに8。9 ~ 9。6 mg / g[2]。

2 .2 .4前兆 

ある条件下では、前駆体は細菌の同化流を制御し、それによって補酵素q10の収量を増加させることができる。清水らは、トリカルボン酸回路中のプロピオン酸が、コエンザイムq10の側鎖2-メチルブテン(2)系ポリマーの前駆体であり、培地にプロピオン酸を0.5%添加すると、コエンザイムq10が52 mg/ l収率で得られることを報告した。コエンザイムq10の生産量は培地に0.5%のプロピオン酸を添加して52 mg/ lであった。河田らは、p . schuy lkilliensisの培地に側鎖合成の前駆体としてイソペンチルエタノールとタローアルコールを添加すると、細菌の補酵素q10含有量が約20 ~ 60%増加することを報告した。tanakaらはシェイクフラスコを用いてc . schuy lkilliensisを培養した。T .田中らは、シェイクフラスコ中でc . t . pk-233株を培養し、培地にp-ヒドロキシ安息香酸を添加すると、補酵素q10の生合成が促進されることを発見した[16]。

2 .2 .し5ッ 

張ヨンギョンら。[17〕捜査、油の相乗効果で、黄粉(きなこ)、人参ジュース、トマトジュースタバコの叶が、β-carotene適量オレンジピールジュースの生产にコエンザイムQ10酵母発酵した結果、上記ッが増えるかもしれコエンザイムQ10イースト菌内での内容を盛り込んでいる。

2 .3培養条件の最適化

2 .3 .1Illumination

佐々木らは、光がない状態で緑膿菌pseudomonas aeruginosaを培養し、コエンザイムq10の量が1.22 mg/g、光がある状態ではコエンザイムq10の量が1.5 mg/gであった。光がない状態では緑膿菌pseudomonas aeruginosaを1.22 mg/gの補酵素q10で培養したが、光がある状態では補酵素q10の濃度が1.98 mg/gであった[16]。carとexcellは、光中の嫌気性条件下では、psb中のコエンザイムq10の含量が高くなるが、暗所で培養すると収量が急激に低下することを報告した[2]。

2 .3 .2、溶存酸素

溶存酸素がコエンザイムq10の発酵に与える影響は、細菌の菌株によって大きく異なります。y0shidaら[14]は、ロドコッカス・グロブラスky-4113の発酵において、酸素圧を下げると補酵素q10の生産量が増加することを発見し、細胞の電子顕微鏡写真から、低酸素条件下で細胞内膜が多層構造を示すことを明らかにした。wang genhuaら[18]は、シェイクフラスコ中の溶存酸素量が細胞の成長だけでなく、コエンザイムq10の産生にも影響することを発見した。溶存酸素が高いほど、細胞の呼吸器系が発達し、補酵素q10の含有量が高くなります。

2 .3 .3接種巻 

接種率を上げると、発酵期間が短くなり、菌の成長速度が速くなり、発酵周期が短くなる。wu zufangら[15]は、rhizobium radioduransを用いたシェイクフラスコ実験(wsh2601)において、最大のコエンザイムq10の収率が接種率4%で得られたことを示した[15]。

2 .3 .4 pH 

初期ph値は真菌による基質の利用速度と細胞の構造状態に影響を与え、真菌の成長速度と代謝産物に影響を与えます。wang genhuaら[18]は、shakeフラスコ実験において、rhizobium leguminosarumがアルカリ性よりも酸性条件下で多くのコエンザイムq10を産生することを示した。細胞内のコエンザイムq10の量が最も多かったのはph 5であった。

3楽しみ

The development and utilization of coenzyme Q10 has become a hot research topic in recent years due to its wide range of applications and high market demand. The production of coenzyme Q10 by fermentation has many advantages, such as high product activity and unlimited raw material sources. However, the low level of fermentation and the complexity of the metabolites have resulted in high extraction costs. In order to improve the industrialization of the fermentation method, high-yielding strains can be selected by regulating the metabolic pathway of coenzyme Q10, and the fermentation level can be further improved through the improvement of the fermentation process. In addition, the study of a set of efficient separation and extraction routes is one of the effective ways to improve the industrialization of the fermentation process.

参照:

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