酵母エキスからのグルタチオンの研究

の large number of studies have shown that the physiological activity of グルタチオンの人々に大きな価値があります'の生産と生活、そしてそれは、食品、医薬品、ヘルスケア製品などの様々な分野で重要な役割を果たしてきました。現在、グルタチオンの工業生産に最も一般的に使用されている方法は純粋な菌株発酵法であり、使用されている菌株は主にsaccharomyces cerevisiaeとescherichia coliである。純粋発酵株は環境条件が比較的厳しく、発酵時間が比較的長い。過程で発酵グルタチオンのコンテンツを増やすを最適化し、状況に基づきグルタチオンの増加の収益率を菌株て理解しでグルタチオンのの高い収益を得るために、働くためには当然、選択の高い株の石高と能力を高めるための株グルタチオンの一定の技術を通っ合成手段(ミュータントたちは、遺伝子工学の交雑または交配繁殖、など)。ある種の技術的手段(突然変異育種、遺伝子工学交配など)によって、株のグルタチオン合成能力を向上させることができる。この方法は工業生産において広く用いられている。

Brewer&#酵母は栄養素が非常に豊富であり、タンパク質、必須アミノ酸、および少量のrnaが大量に含まれており、酵母細胞の細胞壁には酵母多糖類の25%-35%、主にグルカンとマンナンが含まれていることが判明している[87]。近年、中国の急速な発展に伴い'の醸造業界は、ビールの生産は年々増加しています。最新のデータから、中国'のビール生産は2016年から2021年までに約30 ~ 40万トンになり、年間ビール生産は他の国よりもはるかに進んでおり、ビールのすべての200 tは醸造所の3.0 tを生産することができます&#約80%の含水率を有する39;s酵母汚泥。

この実験の目的は、ビール製造後の生ビール酵母から直接グルタチオンを生合成することです。この実験の利点は浪費を利用するための細胞を含んだビール酵母発酵したあとを加え、どろどろ大量の生理活性新直接酵母を投入しグルタチオンの過程でのpre-cultivationの必要を生産せず酵母だけでなく縮め製作節約できた周期やビール酵母も作る安くなるし、豊富です。この方法は厳しい栽培条件は必要ないので、必ずしもの合成グルタチオンの行うことができる十分な原料を薄くなり、手間や低コストの減少を条件に経済的な利益をだけでなくできるビールメーカー、資源の有効活用に取り組みをかなえる問題解きも資源の無駄遣いや、環境汚染の懸念が重要な経済・社会効果を持っている。

1. 導入

の生産酵母発酵によるグルタチオン国内外で研究されており、発酵方法には明らかな利点があり、グルタチオンの生産に使用される菌株は主に細菌や酵母細胞です。これらの細胞は培養が容易で取り扱いが容易であり、反応条件は穏やかである。そのため、グルタチオンの製造には発酵が最も一般的な方法となっています。

醸造所の最適化'の酵母培養プロセスは、細胞によるグルタチオンの合成における窒素および炭素源、金属イオン濃度および前駆体アミノ酸の影響を含むグルタチオン発酵の栄養条件および環境要因に焦点を当てています。

グルタチオンの直接合成に関する報告は多くない 真水からbrewer&#tankering後の39の酵母。本章では,酵母によるグルタチオン合成に対する培養成分,培養条件,前駆体アミノ酸添加戦略の影響's酵母を対象に、グルタチオン産生の改善を目的とした一方向最適化実験と応答面解析実験により、最適な生合成条件とアミノ酸付加戦略を明らかにした。

2.実験

実験材料2.1

Brewer' s酵母は煙台木平醸造所(ビール製造後に醸造所から新鮮な酵母)によって提供されました。以来、新鮮なビール'の酵母は、限られた寿命を有し、長期的な実験は醸造所の異なるバッチを使用する必要があり、長い時間のために残された場合、その生理学的活性を失う傾向があります' s酵母、させて必然的に生理活動にずれが生じていた結果、詳細にグルタチオンのを合成しに確保を最小化するため実験誤りやデータの精度を確保しようと試みたんですがも同様ののバッチを含んだビール酵母を同じレベルが原因となっています。の下実験誤差を最小化し、データの正確性を確保するために、私たちは同じ醸造所のバッチを使用するように最善を尽くします&#同じ要因とレベルの下での実験のための39の酵母。

2.2材料と試薬

テーブル2 .1材料と試薬

2.3主な機器・設備

表2.2機器・装置

2.3基本メディア

フラスコを振る培地:25 g/ lグルコース、10 g/ lペプトン、1.0 g/ l k2hpo4、1.0 g/ l kh2po4、0.3 g/ l cacl2、2.5 g/ l mgso4、0.05 g/ l feso4。

プレ・ミディアムの構成は上記の通りで、ポスト・ミディアムは最適化プロセスでいくつかの調整を行います。

2.4栽培条件

前処理された醸造所の一定量' s酵母スラッジをコニカルフラスコに添加し、培地の体積に対する酵母スラッジの体積の20%の割合で徹底的に混合して酵母スラッジを溶解させた。発酵時間24 hだった、発酵気温は28℃揺れ速度は160 rpm、そして巻の液体が300 mLで24 mL /た試料を採取幹細胞バイオマスの集光型太陽熱3.0 hます、総グルタチオンの細胞内内容が3つ並ん設定の実験で決定される。

2.5測定方式

2.5.1 Brewer' s酵母前処理

注文生きている生ビール酵母モルタル:生きている生ビール酵母使用Muping醸造から内部巻の2倍スポンジ弾薬筒の水を加えて口を漱いで4 ~ 5回砕けろ酵母が使用する廃棄し、上澄み、浮遊物质た繰り返し洗い流し上層まで黄色をからも無色になりした液が、その後、上澄みを捨て十分静と数年は大成功し酵母モルタル4.0℃冷蔵庫使用されつつある。

Brewer&#グルタチオン決定のための39 s酵母細胞前処理:醸造所の発酵スープの5.0ミリリットルを取る' s酵母細胞と遠心分離をすることにパイプ,遠心分離機クレセントアベニュー4500でrpm、上澄みを捨て、エタノール40%解決策を加え抽出h " 2.0である4000℃遠心分離機5000 rpmで変わっ、上澄み薄まり一定数の回として使用されることが確実視されるサンプル決定部171います

2.5.2醸造所の細胞バイオマスの測定' s酵母

Brewer&#遠心分離および遠心管によって得られた39 s酵母生物を80°cのオーブンで一定の重量に乾燥させ、正確に計量し、醸造所の総重量を測定した'sの酵母生物および遠心分離機管は、(w1)と計量した。その後、乾燥した醸造所&#遠心管内の酵母生物を洗い流し、遠心管を一定の重量に乾燥させ、遠心管の重量を(w0)、遠心管の総重量を(w0)とした。w (g) = w1-w0。

2.5.3グルタチオンの測定方法

Tetroxidine方法[64]:は簡単1.0 mLサンプルの溶液実験されされたものに、0.1 mol 0.5 mL加え/ Lグリコール酸、350 mL燐酸0.24 mol / Lの緩衝溶液、mL 1.0 g / L Tetroxidine 1.0%などになる解決方法反応を20分徹底的に検証するため、そしての305のabsorbance値再送間隔紫外線分光カメラで測定される305 nm。

2.6実験する方法

2.6.1ビール酵母発酵時間の測定

の焼き上げるbrewer's酵母汚泥を20%の体積で媒体と混合し、8%の体積でフラスコを振るために添加した。発酵は30時間連続で28℃、回転数160 rpmで行われた。酵母醗酵培養液5.0 mlを3時間ごとに摂取し、酵母の全グルタチオン、細胞内含有量、細胞バイオマスを測定した。並行して3グループの実験が行われた。

2.6.2主な培養条件と栄養組成の影響

2.6.2.1合成されたグルタチオンに対する負荷量の影響

この実験では、300 mlのシェイクフラスコに6%、8%、10%、12%、14%の醸造所を充填しました's酵母発酵スープと24の温度で28時間インキュベートし、160 rpmの回転速度。最適積載量は、醸造所のグルタチオン、細胞内グルタチオン、バイオマスの合計量を計算して決定しました'sの酵母細胞、および3つのグループが並列実験のために設定されました。

2.6.2.2グルタチオンの合成に対する温度の影響

本実験では、醸造所の全グルタチオン、細胞内グルタチオン、細胞バイオマスを計算して最適温度を決定しました's酵母を24℃、26℃、28℃、30℃、32℃に置き、実験2.6.2.1で最適な負荷量を決定し、24時間160 rpmの回転速度でインキュベーションを行った。並行して3つの実験が行われた。

2.6.2.3合成されたグルタチオンに対するグルコース濃度の影響

本実験では、前回2.6.2.1および2.6.2.2で決定した最適負荷量と温度下で、15 g/ l、20 g/ l、25 g/ l、30 g/ l、35 g/ lの4段階のグルコース濃度を設定し、160 rpmで24時間培養した。醸造所の全グルタチオン、細胞内グルタチオン含有量、細胞バイオマスを計算して最適なグルコース濃度を決定した' s酵母。並行して3つの実験が行われた。

2.6.2.4合成されたグルタチオンに対するペプトン濃度の影響

ペプトン濃度は、15 g/ l、20 g/ l、25 g/ l、30 g/ l、35 g/ lの4段階が用いられた。インキュベーションは、前回の実験で決定した最適負荷、温度、グルコース濃度の下で、24時間160 rpmで行いました。醸造所の全グルタチオン、細胞内グルタチオン、細胞バイオマスを計算して最適なペプトン濃度を決定した' s酵母。並行して3つのグループが設立された。

2.6.2.5合成されたグルタチオンに対する硫酸マグネシウム濃度の影響

この実験では、硫酸マグネシウムをそれぞれ1.5 g/ l、2.0 g/ l、2.5 g/ l、3.0 g/ l、3.5 g/ lの4段階添加しました。実験で決定した最適負荷量、最適温度、最適グルコース濃度の下で、160 rpmで24時間インキュベーションを行った。最適な硫酸マグネシウム濃度は、グルタチオンの総量、細胞内グルタチオン含有量、醸造所のバイオマスを計算して決定しました' s酵母細胞です並行して3つの実験が行われた。

2.6.3培養条件を最適化するための応答表面法

一方向実験の結果に基づいて、グルコース濃度(a)、硫酸マグネシウム濃度(b)、温度(c)の3つの因子を選択し、box-behnkenによって実験デザインを最適化し、実験の因子とレベルを表2.3に示した。

表2.3実験因子と水準

ファクターシンボルレベル1レベル2レベル3

2.6.4前駆体アミノ酸濃度と添加時間の影響

本実験では,酵母の生合成過程における前駆体アミノ酸の付加戦略を最適化した#グリシン(gly)、グルタミン酸(glu)、システイン(cys)の濃度と、3つの前駆アミノ酸の添加時期を含めて、最終的に合成されたグルタチオンの総量から最適な添加濃度と時間を決定しました。3つの前駆アミノ酸の初期添加濃度は、glyで10 mmol/ l、gluで6 mmol/ l、cysで4 mmol/ lであり、醸造所では21 hであった#39;sの酵母細胞、および醸造のための24時間' s酵母細胞です

2.6.4.1グルタチオン合成に対するgly濃度の影響

3つの前駆アミノ酸を加えた結果、gluとcysの初期濃度はそれぞれ6 mmol/ lと10 mmol/ lに変化せず、glyは3.0 mmol/ l、6.0 mmol/ l、9.0 mmol/ l、12 mmol/ l、15 mmol/ lに変化した。glyの最適濃度は、全グルタチオン量、細胞内グルタチオン含有量、細胞バイオマス指標を計算して決定しました。醸造所の全グルタチオン、細胞内グルタチオン含有量と細胞バイオマス's酵母を計算して、glyの最適濃度を決定し、グルタチオン合成に対する効果を調べました。並行して3つの実験が行われた。

2.6.4.2グルタチオン合成に対するglu濃度の影響

gluの最適濃度は3.0 mmol/ l、6.0 mmol/ l、9.0 mmol/ l、12 mmol/ l、15 mmol/ lとし、グルタチオンの総量、細胞内グルタチオン含有量、醸造所のバイオマス指標を計算して最適濃度を決定した#39; s酵母細胞です醸造所のグルタチオンの総量、細胞内グルタチオン含有量、細胞バイオマス&#酵母を計算し、gluの最適濃度を決定し、gluがグルタチオン合成に与える影響を調べた。並行して3グループの実験が行われた。

2.6.4.3グルタチオン合成に対するcys濃度の影響

上記の実験では、glyとgluの最適濃度はそのままにし、cysの濃度を2.0 mmol/ l、4.0 mmol/ l、6.0 mmol/ l、8.0 mmol/ lに変更しました。醸造所のグルタチオン含有量と細胞内グルタチオン含有量の合計とバイオマス指標'sの酵母細胞を計算し、cysの最適濃度を決定し、グルタチオン合成への影響を調べた。最適なcys濃度は、グルタチオンの総量、細胞内グルタチオン含有量、醸造所のバイオマス指標を計算して決定した'sの酵母細胞は、グルタチオン合成に対するcysの効果を調査する。並行して3つの実験グループが設立された。

2.6.5前駆体アミノ酸濃度を最適化する応答表面法

一方向実験の結果に基づいて、グリシン濃度(a)、グルタミン酸濃度(b)、システイン濃度(c)の3つの因子を選択し、box-behnkenが実験計画を最適化した結果を表2.4に示す。

表2.4実験因子と水準

注:グリシン、グルタミン酸、システイン濃度はmmo/ lである。

2.6.6グルタチオン合成に対する前駆体アミノ酸添加のタイミングの影響

3つの前駆体アミノ酸の最適濃度を決定した後、前駆体アミノ酸の添加時間が醸造所によるグルタチオンの合成に与える影響&#酵母を調べたところ、添加時間はそれぞれ13時間、16時間、19時間、21時間、24時間となった。のbrewer&#酵母を24時間培養し、グルタチオンの総量、細胞内グルタチオン含有量、醸造所のバイオマスを計算して前駆体アミノ酸の最適添加時間を決定しました' s酵母細胞です並行して3つの実験が行われた。

2.6.7醸造所の貯蔵寿命の決定' s酵母

この実験では、細胞の成長の変化とその総量を測定しましたglutathione(グルタチオン)醸造所によって生産されます' s酵母25 dの期間にわたって、結果は新鮮な醸造所の初日から得られました日に39の酵母コレクション。細胞バイオマス、醸造所の全グルタチオンと細胞内グルタチオン含有量&#採取初日から培養開始25日目まで、毎日39種の酵母を測定した#39の酵母は、4で冷蔵庫に格納されています孵化前、および醸造所の孵化後' s酵母は前駆体アミノ酸の添加、および細胞バイオマス、総グルタチオンおよび醸造所の細胞内グルタチオン含有量の増分増加と24時間のために最適化&#培養前後の酵母を計算した。全グルタチオン量と細胞内グルタチオン量の漸進的変化を酵母の培養前後に計算した。

2.7結果と分析

2.7.1ビール酵母細胞の発酵時間の測定

酵母の全グルタチオン、細胞内グルタチオン含有量およびバイオマスを測定し、30時間の醸造後に計算した結果'の酵母細胞培養、結果を図2.1にプロットしたところ、そこから醸造所がわかる's酵母細胞は、細胞が成長し続けているように0時間から13時間までの期間中に細胞内グルタチオンを合成し、その醸造所's酵母は基本的に増殖を停止し、13時間から26時間までグルタチオンを合成していたが、30時間の培養後に全グルタチオン含有量を測定し、酵母の全グルタチオン含有量とバイオマスを図2.1にプロットした。13 hから26 hで、醸造所の成長&#グルタチオンがまだ合成されている間、39;sの酵母細胞は基本的に停止した。研究によると、この2つの段階で前駆体アミノ酸を添加すると、グルタチオンの産生が増加することが示されています[62]。酵母のグルタチオン含有量、細胞内グルタチオン含有量、バイオマスの合計は、ビール製造直後の醸造所の新鮮な酵母細胞において102.42 mg/ l、4.66 mg/g、21.46 g/ lであった。実験データから分かるようにもしグルタチオンの抽出したら、グルタチオンのの収益率低が低く、経済の実际の利益とする説が利用場所で新たな酵母だけ水槽、ターゲットをrecultivationグルタチオンのsynthetizingの地形を活かし酵素システムの新鲜な酵母の细胞が合う栄養や文化を提供する条件生に向けてさらなるグルタチオンの。図2.1に示すように、24時間培養後のグルタチオン、細胞内グルタチオン、酵母のバイオマス総量はそれぞれ26.82 g/ l、7.79 mg/g、208 mg/ lに達した。時間的要因を考慮して24時間という最適発酵時間が決定され、純粋発酵に比べて大幅な時間と資源の節約が可能となった。

図21 Brewer'の酵母の成長とグルタチオン合成曲線。

2.7.2主要な培養条件と栄養素の影響

2.7.2.1グルタチオン合成に対する負荷量の影響

実験に投入される液体の量は、主に醸造所の溶存酸素レベルと考えられます&#醸造所の成長に影響を与える39 sの酵母細胞培養媒体'の酵母細胞だけでなく、ある程度まで細胞内グルタチオンの合成。

図2.2グルタチオン合成における負荷量の影響

図2.2液体負荷によるグルタチオン合成の影響

図2.2は、グルタチオンの総量、細胞内グルタチオン含有量、酵母細胞のバイオマス量が、負荷量の増加に伴って増加し、減少することを示しています。この主な原因は、積載量が少ない時に酸素供給が十分であったことと、醸造所の成長があったことと考えられます#39の酵母は活発で、醸造所のバイオマスが増えました's酵母細胞はグルタチオンの総量を増加させ、醸造所のバイオマスを増加させた&#酵母細胞は8%の積載量で最大値27.12 g/ lに達し、醸造所のバイオマス'の酵母細胞は徐々に負荷量の増加に伴って減少したので、醸造所の成長'の酵母細胞は、より大きな負荷量で阻害され、醸造所の成長'の酵母細胞は、より大きな負荷量で阻害される。総グルタチオンは212.07 mg/ l、細胞内グルタチオンは7.82 mg/gで最大値8%に達した。

2.7.2.2グルタチオン合成に対する温度の影響

温度は、酵母細胞の成長に影響を与える最も重要な要因の一つです。温度は、グルタチオン合成酵素活性に影響を与えます,順番に醸造所の能力に影響を与えます's酵母はグルタチオンを合成し、グルタチオン産生の違いをもたらす。酵素活性に対する温度の影響は、一般的に、温度が低すぎる、または高すぎると酵素活性が低下し、最適な温度でのみ酵素活性が最大化されるということです。

図2.3に示すように、酵母細胞のバイオマスとグルタチオンの合成能力は温度上昇に伴い増加し、28℃で全グルタチオン、細胞内グルタチオン、酵母細胞バイオマスの最大値はそれぞれ216.51 mg/ l、7.85 mg/g、27.62 g/ lであった。

図2.3温度によるグルタチオン合成の影響

2.7.2.3グルタチオン合成に対するグルコース濃度の影響

グルコースは、酵母細胞の成長と再生およびグルタチオンの生合成に不可欠である。グルコースは酵母細胞に成長に必要なエネルギーを供給する一方で、グルタチオンの合成にはatpも供給し、グルタチオンの合成を促進します。ブドウ糖の右の濃度だけでなく、醸造所の成長を容易にします'の酵母細胞だけでなく、グルタチオンの合成 形成されています

図2.4グルタチオン合成に対するグルコース濃度の影響

図2.4グルタチオン合成に対するグルコース濃度の影響

図24に示すように、生、グルタチオンのブドウ糖濃度の増加し、グルタチオンの総額内グルタチオンの内容やバイオマスの酵母の細胞は25 g /最大値に着いLブドウ糖、mg / L 211.52れmg / L 7.82 mg / g, 27.82 g / Lと。グルタチオンは211.52 mg/ l、細胞内グルタチオンは7.82 mg/g、酵母細胞バイオマスは27.82 g/ lとそれぞれ最大値に達した。

2.7.2.4グルタチオン合成に対するペプトン濃度の影響

窒素源は、酵母細胞の成長のための重要な条件の一つであり、異なる有機窒素源は、酵母内の細胞内物質の成長と合成に一定の影響を与えます。実験は、主に醸造所によるグルタチオンの合成に対する異なるペプトン濃度の影響を調査しました' s酵母。図2.5からわかるように、グルタチオンの総量に対するペプトン濃度の影響は大きくなく、醸造所のバイオマスへの影響も少ない'の酵母細胞も重要ではありません。全体的に、ペプトン濃度がグルタチオンの生成に与える影響は明らかではなく、コスト削減の観点から、研究の後期段階では培地にペプトンを添加しない方がよいと考えられる。

図2.5グルタチオン合成に対するペプトン濃度の影響

2.7.2.5グルタチオン合成に対する硫酸マグネシウム濃度の影響

Magnesium ion is essential for the 合成グルタチオンの,グルタミン-システインシンテターゼの活性を高めることができます(グルタチオン1)およびグルタチオン合成酵素(グルタチオン2),グルタチオン1のフィードバック阻害を減少させ、酵素活性を向上させます[54]。したがって、培養過程で適切な硫酸マグネシウムを添加することは、グルタチオンの合成に有益であり、グルタチオンの総生産を向上させる。

図2.6から、mgso4の濃度が醸造所によるグルタチオンの合成に比較的大きな影響を与えていると結論することができます'の酵母、また、醸造所の成長に大きな影響を与えます' s酵母細胞ですmgso4濃度の上昇に伴い、グルタチオンと細胞バイオマスの総量が増加し、醸造所の総量と細胞内含有量と細胞バイオマスが増加した&#mgso4の濃度が2.5 g/ lで最大となったのは39 s酵母で、212.88 mg/ l、7.81 mg/g、27.25 g/ lであったため、mgso4の最適濃度は2.5 g/ lと決定することができた。212.88 mg/ l、7.81 mg/g、27.25 g/ lであるため、mgso4の最適濃度は2.5 g/ lと決定することができる。mgso4の濃度は2.5 g/ lであった。

図2.6 mgso4濃度のグルタチオン合成への影響

2.7.3培養条件を最適化するための応答曲面設計実験

上記の一方向実験の結果に基づいて、醸造所でのグルタチオン生合成のための培養条件の最適化'の酵母、の結果

design expert 10.0を用いて応答曲面設計(rsd)実験を行い、グルコース濃度(a)、硫酸マグネシウム濃度(b)、温度(c)がグルタチオン(y)の総量に及ぼす影響を調べ、応答曲面解析(rsa)により解析した。

2.7.3.1ボックスベンケン回帰分析

表2.5 box-behnkenの設計と結果

醸造所におけるグルタチオン合成に関する3因子3レベル応答曲面設計実験' s酵母をdesign expert 10.0ソフトウェアを用いて行い,その結果を回帰分析により分析した。醸造所が生合成した全グルタチオンの選択係数の二次多項回帰式&#y = 194.56+ 5.04* a—5.61* b—7.53* c + 0.14* ab—0.20* ac + 5.07* bc + 7.99* a—2 5.04* a- 12.61* b-7.53 * c +0。14 * AB-0.20 * AC +×紀元前+ 7.99×A2 7000万-

37. 13* b2—46.98* c2 2.7.3.2分散分析(anova)

表2.6回帰式の分散分析

注:R2 = 0.9969;R2Adj = 0.9930;「※チャーリー~有意差を示す(p <0.05);「* *チャーリー~^ a b c de f gh i (p & p)。

から分かるようにテーブル2.6で、252.64のF値モデルがありP及びb価値は< 0.0001、差が指摘され歴然復帰モデルがありR2 = 0.9969 99.69%た可能性が指摘されて説明できる変形モデルのR2Adj = 0.9930試作模型の製作に大きなましたがた可能性が指摘され的価値観R2and R2Adj比較的近接していてより合理的復帰モデルがありた可能性が指摘され等式はそれをにふさわしいと思いr2とr2adjの値は互いに近いので、回帰モデルが妥当であり、方程式の適合度が高く、実験誤差が小さいことを意味し、モデルを使用して醸造所におけるグルタチオン合成の培養条件を分析および予測することができます' s酵母。から浮き立ち术语は0.9820 > P-value 0.01、から浮き立ちの違いが指摘されていた用語ではない围绕,すなわちモデルが赤字を出さずにバラ現象モデルの実験を説明できるまあモデルはのブドウ糖の相乗効果で、を分析するための硫酸マグネシウムと体温グルタチオンのな最適なを得る対策の分子レベルを指摘した。

In the model, except for AB, AC and 紀元前, all the items are significant, of which A is significant, B, C, A2, B2 and C2 are highly significant, indicating that glucose has a great influence on glutathione production, magnesium sulfate and temperature have a great influence on glutathione production, and the relationship between the influence of the three factors is B (magnesium sulfate) > C (temperature) > A (glucose).

2.7.3.3応答曲面分析

モデル式の一次項と二次項の結果を組み合わせることにより、グルコース(a)、硫酸マグネシウム(b)、温度(c)が醸造所によるグルタチオン合成に与える影響を結論することができる'の酵母は複雑であり、単純な線形関係ではなく、応答曲面効果が顕著です。応答曲面図を図2.7に示します。

図2.7因子の応答曲面図醸造所によるグルタチオン合成における因子の相互作用' s酵母

(a)硫酸マグネシウム-グルコース(b)グルコース-温度(c)温度-硫酸マグネシウム

図2.7ビール酵母によるグルタチオン合成に対する様々な因子の相互作用の応答曲面図

図2.7から、上記の一方向実験の結果は、影響を与える因子のレベルの増加に伴ってグルタチオンの総量が増加し、その後減少するという応答曲面設計(rsd)実験の結果と一致していることがわかる。応答曲面計画の実験では、さまざまな因子の相互作用が実験結果に与える重要な影響を明確に反映することができます。応答曲面の傾きは、グルタチオンの総量に対する因子の効果の強さを表します。

応答曲面の等高線が楕円に近いほど、2つの因子間の相互作用が実験結果に与える影響が大きくなります。応答曲面の等高線が円に近い場合、2つの因子の相互作用が実験結果に与える影響は小さくなります。図からは、温度と硫酸マグネシウムの相互作用以外では、グルタチオンの総量に有意な影響は見られなかったことがわかる。

回帰モデルを解析することで、醸造所によるグルタチオン合成の最適条件を明らかにしました&#酵母のグルコース濃度は24.66 g/ l、硫酸マグネシウム濃度は2.41 g/ l、温度は28.10℃で、この条件下でのグルタチオンの総量は195.64 mg/ lであった。検証実験では、上記の条件を繰り返し、実際の総グルタチオン量は198.62 mg/ lでした。実験を繰り返して得られた全グルタチオン量と予測値との差は大きくなく、このモデルで醸造所の培養条件を予測できることが示された' s酵母合成のグルタチオンのいいから得られるグルタチオンの総額表面分析の反響が少しから取得したより低い片道最適化実験で、私は言うのが主な原因で応答表面分析実験、一方通行の最适化実験違います一方向最適化実験と応答面最適化実験を別々のバッチで実施したため、応答面最適化実験で得られたグルタチオンの総量は一方向最適化実験よりも若干少なくなりました#2.2.1実験材料に記載されているように39;s酵母、その結果は、わずかに異なっていた。

2.7.4前駆体アミノ酸濃度および添加時間の影響

醸造所におけるグルタチオンの合成' s段階酵母細胞は違う反応、前駆アミノ酸は参加を合成するのにグルタチオンの反応に中間物質ように、偽物だっことになりましたreactantsの濃度値がすでに一定の製品の合成への影響力と、のための必須物質効果が適切な時期であるという说があり、この保护には制品の合成そこで、前駆体アミノ酸を添加し、生合成の最適なタイミングで濃度と添加時間を最適化する必要があります' s酵母。そのため、酵母の生合成段階で最適なタイミングで前駆体アミノ酸を添加する必要があります#39の酵母、および前駆体アミノ酸および添加時間の濃度を最適化します。

2.7.4.1合成グルタチオンに対するgly濃度の影響

glyはグルタチオン合成の第二段階の反応剤である 合成から中間γ-glutamylcysteine、ATPとGlyとともに解媒上下線とも2グルタチオンの停車する。そのため、glyの濃度はグルタチオンの合成に一定の影響を与えます。

図2.8合成されたグルタチオンに対するgly濃度の影響

図2.8に示すように、グルタチオンの濃度が上昇すると、グルタチオンの総量と細胞内グルタチオン量、細胞バイオマス量が増加しており、グルタチオン濃度が上昇すると醸造所の成長が促進されるだけではないことがわかります'の酵母細胞だけでなく、醸造所によるグルタチオンの合成を容易にします' s酵母。のGlyの濃度は12 mmol / L,、総額グルタチオンの細胞内コンテンツ最大値に達しており、集中しているの増加と、総額グルタチオンの細胞内コンテンツ減少へと転じ、この時点でグルタチオンのは計3560万mg / L 302.54 mg / L細胞脱出内容も8.98 mg / g、バイオマス约セルラー/ L 33.62 gであった。従って、全グルタチオンの最大値時のglyの最適濃度は12 mmol/ lであった。その結果、glyの最適濃度は全グルタチオンの最大値で12 mmol/ lであった。

2.7.4.2グルタチオンに対するglu濃度の影響

Gluは主要な2つのreactantに「グルタチオンのが合成さとglutathione1同時に合成γ-glutamylcysteine ATPのエネルギー供給の下の濃度Glu効果があるという说が人工的グルタチオンのです図2.9はグルタチオンの総額が次第にGlu集中力が増加して、グルタチオンの総額、内コンテンツ、バイオマス约セルラー、ターンオーバーは6.0 Glu濃度ときには最大値人にのぼるmmol / L, mg / L 309.85れmg / L 9.12 mg / g, 8600 g / LとそれぞれGlu濃度の増加と、後援金の総額細胞内コンテンツ減少へと転じ、しかしに影响を及ぼすセルラーがバイオマス減少へと転じた。gluの濃度がさらに上昇すると、グルタチオンの総量と細胞内含有量が減少し始めましたが、細胞バイオマスへの影響は大きくありませんでした。そのため、グルタチオン合成に最適なglu濃度は6.0 mmol/ lと決定された。グルタチオンの合成段階におけるgluの濃度は6.0 mmol/ lと決定された。

図2.9 glu濃度のグルタチオンに対する影響

2.7.4.3グルタチオンに対するcys濃度の影響

の初期基板CysもGluも知識を得ること「グルタチオンのが合成さの合成グルタチオンの中間(γ-glutamylcysteine)はATPで解媒、グルタチオンの1の濃度Cys効果があり合成います

図210グルタチオンに対するcys濃度の影響

図2.10に示すように、cysの濃度が上昇すると、まずグルタチオンと細胞バイオマスの総量が増加し、その後徐々に減少していくことから、cysが醸造所の成長を抑制する効果があることがわかります#39の酵母、およびcysの濃度が高いほど、醸造所の成長に明らかに阻害' s酵母細胞ですcys濃度が4.0 mmol/ lのとき、グルタチオンと細胞内総含有量は最大値に達し、最大値は310.42 mg/ lで、対照群より51.33%高くなった。

2.7.5前駆体アミノ酸濃度を最適化するための応答表面法

上記の一方的な実験の結果に基づいて、醸造所でのグルタチオンの合成について'の酵母前駆体アミノ酸の濃度を最適化します。

利用はこの実験を行い表面グリシン濃度のデザイン専門家10.0などに与える影响を调べるため(A)グルタミン酸濃度(B)およびて濃度(C)総額グルタチオンの(Y)、、大仏殿の応答表面分析が行われ、実験の結果のテーブル2.7分析で示される分散(ANOVA)はテーブル2.8で示されるます

2.7.5.1ボックスベンケン回帰分析

表2.7 box-behnkenの設計と結果

design expert 10.0ソフトウェアを用いて、醸造所におけるグルタチオン合成条件について実験の3因子3レベル応答曲面設計を行った&#その結果を回帰分析で解析し、醸造所で生合成されたグルタチオンの総量を求めた#39; s酵母。

グリシン濃度(a)、グルタミン酸濃度(b)、システイン濃度(c)の選択係数に対する二次多項回帰式:y =313.77+10.08* a +2.62* b -14.92* c +0。17×AB + 0.018×AC-0。紀元前15 * ~ 23.88 * A2-13.29 * B2-53.22 * C2

2.7.5.2分散分析(anova)

表2.8に示すように、f値は275.81、p値は<0.0001で、回帰モデルの差が大きいことがわかります。R2 =示す0.9972 99.72%変形説明できるモデルのR2Adj = 0.9960に指示したと良いの意義モデルがありの値R2やR2Adjが比較的近接していてより合理的復帰モデルがありた可能性が指摘され方程式fitあっていい。r2とr2adjの値が互いに近いことは、回帰モデルが妥当であり、方程式の適合度が高く、実験誤差が小さいことを示しています。

表2.8回帰式の分散分析

注:R2 = 0.9972;R2Adj = 0.9936;「※チャーリー~有意差を示す(p <0.05);「* *チャーリー~^ a b c de f gh i (p & p)。

「あてはまらない」項のp値は0.1092>0.01であり、「あてはまらない」項の差が有意でないこと、すなわち、モデルにあてはまらない現象がなく、モデルは実験をうまく記述することができたことを示しています。このモデルを用いて、グルタチオン産生に対するグルタミン酸、グルタミン酸、システインの影響を解析し、最適な応答分子レベルを明らかにしました。モデルで、AB以外の全ての項目大きなAC、BCカードのBは围绕,、C、A2 B2及びC2は歴然でし、グルタミン酸濃度はすでに不況を及ぼす影響をグルタチオンのの机械刈取やグリシン、て濃度影响を与えるグルタチオンのの机械刈取三者の関系を要因はC(て)> A(グリシン)> B(グルタミン酸)。C(て)>A(グリシン)>B(グルタミン酸)。

2.7.5.3Responseたら表面分析

モデル式の一次と二次の項の結果を組み合わせると、グリシン濃度(a)、グルタミン酸濃度(b)、システイン濃度(c)が醸造所によるグルタチオン合成に与える影響がわかります'の酵母は単純な線形関係ではなく、複雑であり、応答曲面効果は重要です。応答のプロットを図2.11に示します。

図である。11 .グルタチオン合成に対する前駆体アミノ酸の応答曲面図&#因子の相互作用による39の酵母

(a)グルタミン酸-グリシン(b)グリシン-システイン(c)システイン-グルタミン酸

Figure.2. 11 Response surface diagram of interaction of precursor amino acids with beer yeast for synthesis of glutathione From Figure 2.11, it can be seen that the results of the above one-way experiments are consistent with the results of the response surface design (RSD) experiment, in which the total amount of glutathione increases and then decreases with the increase in the levels of the influencing factors. The response surface design experiment can clearly reflect the important influence of the interaction of various factors on the experimental results. The slope of the response surface reveals the strength of the effect of each factor on the total amount of glutathione. The closer the contour of the horizontal plane of the response surface is to an ellipse, the more significant is the effect of the interaction between the two factors on the experimental results.

応答曲面の水平面の等高線が円に近いほど、実験結果に対する2つの因子の相互作用の影響は小さくなります。図からわかるように、グリシンとシステインの相互作用は、グルタチオン全体では有意ではなかったが、因子間の相互作用は有意であった。

回帰モデルを解析することで、醸造所におけるグルタチオン合成の最適条件&#酵母はグリシンが12.64 mmol/ l、グルタミン酸が6.30 mmol/ l、システインが3.72 mmol/ lで、グルタチオンの総量は316.01 mg/ lであった。検証実験では、上記の条件を繰り返し、実際のグルタチオン量は315.65 mg/ lでした。実験を繰り返して得られたグルタチオンの総量は、予測値とあまり変わらず、このモデルが醸造所におけるグルタチオン合成の培養条件を十分に予測できることを示した' s酵母。

2.7.6グルタチオンに対する前駆体アミノ酸付加時間の影響

Brewer&#第一段階は、酵母細胞自体が増殖し、酵母の合成の少量のグルタチオンで、数が増加している酵母細胞自体の成長である。第2段階は、細胞内のグルタチオンを合成することで、ブドウ糖などの栄養素が枯渇し、細胞自体の数がピークに達した後、細胞内の内容物を合成し、大量のグルタチオンを合成することで、梁斌らが研究している。第二段階は細胞内のグルタチオン合成段階で、培養成分中のグルコースなどの栄養素が枯渇して細胞の数がピークに達した後、細胞の内容物が合成され、大量にグルタチオンが合成される。30時間の培養後、細胞内含有量は10.41 g/ lで、対照より10.5%増加し、グルタチオン産生量は278 mg/ lで、対照より116%増加した。

関連する研究では、グルタチオン合成の段階で前駆体アミノ酸を添加すると、さらにグルタチオンの総量が増加することが示されています#この実験では、酵母に前駆アミノ酸を添加する時間を設定しました&#細胞培養の13、16、19、24時間で39;s酵母細胞。

図である。12グルタチオンに対する混合前駆体アミノ酸の添加時間の影響

のリンゴ。12前駆体アミノ酸付加時間のグルタチオンへの影響

As shown in Figure 2.12, with the increase of addition time, the glutathione content and intracellular content reached the maximum value at 21 h, and the cell biomass also reached the maximum value, but there was not much difference in the overall level, and the total amount of glutathione, the intracellular glutathione content, and the biomass of the yeast cells decreased significantly at 24 h, which was close to the maximum production of glutathione in yeast cells under optimized cultivation conditions but without the addition of precursor amino acids. The total glutathione amount, intracellular glutathione content and yeast cell biomass decreased significantly at 24 h, which was close to the maximum production of glutathione in yeast cells under optimized culture conditions without the addition of precursor amino acids. The reason for this may be that the addition of precursor amino acids at 24 h was the end of the fermentation of brewer'の酵母細胞と酵母 細胞は、短い時間で前駆体のアミノ酸から自身のグルタチオンを合成することができませんでした。21歳の時、時間はh、最大グルタチオンの内容はmg / L 315.87 mg / Lのより52.51%管轄自治体で最適な、時間は21 hに確定される。その結果、酵母がグルタチオンの生産取締り班に比べて高い」だった。

2.7.7醸造所の細胞保持時間の測定' s酵母

実験的な調査の中で、醸造所&#酵母は、同じ条件下でグルタチオンを合成する能力が、新鮮な醸造後の貯蔵時間の延長とともに低下することを発見しました&#酵母が回収され、貯蔵時間が長くなると酵母のグルタチオン合成能力が低下した。そこで、実験データの安定性を確保するために、醸造所の保管時間'の酵母細胞は、実験が醸造所の能力の低下の前にできるだけ早く行われたことを確認するために測定されました&#実験結果の正確さを正確に把握するために、39の酵母細胞は、グルタチオンを合成します。

図である。13醸造所における細胞バイオマスの変化とグルタチオン生産の増加's酵母25 d以上の最適化の前と後。

図2.13から、貯蔵時間の増加に伴って最適培養槽のバイオマス増強率&がわかる#39の酵母細胞は徐々にその醸造所の成長を示した、減少&#長い貯蔵時間を持つ39の酵母細胞は、最適化後に大幅に増加しなかった、とこれは、醸造所の活性という事実に主に起因する可能性があります&#酵母細胞は多く失われ、グルタチオンの総量の増加も少なく、その後の分離実験には役立たなかった。

ビールの生理的活動' s酵母は貯蔵時間が長くなると減少し、低温での貯蔵時間が長くなると成長とグルタチオン生産能力が低下する。グルタチオンの総額、細胞内グルタチオンのコンテンツ、バイオマス约酵母セル増加率5%を减らして、7% 9%、それぞれが蓄積時間は危ういわ5 d以上あったため、力を育成することが方が酵母第一後5 dさわやか内酵母は戦車からはずされ生物学的収益を増やすため合成されたグルタチオンのれbrewer' s酵母。したがって、新鮮な醸造所を取った後の最初の5 d内のグルタチオン生産のための酵母をインキュベートすることをお勧めします&#醸造所によるグルタチオン生合成の収率を増加させるために、タンクから39の酵母' s酵母。

3. 概要

今回の実験では、brewerr &を用いた#酵母細胞を株として、酵母の能力を高めるための培養条件や前駆体アミノ酸添加戦略を検討's酵母自身でグルタチオンを合成する。以下の結論が得られた。

（1）Through the one-way optimization of the culture conditions, it was finally determined that the main components of the culture medium were glucose and MgSO4, with the concentrations of 22 g/L~28 g/L and 2.0 g/L~3.0 g/L, respectively, and the external conditions of 26℃~28℃, with a liquid volume of 8%. On the basis of the response surface design method, the three main factors of glucose concentration, magnesium sulfate concentration and temperature were further optimized to obtain the optimal process conditions: glucose concentration of 24.66 g/L, magnesium sulfate concentration of 2.41 g/L, and the temperature of 28.10 ℃. Under these conditions, the total amount of glutathione was 198.62 mg/L, which was 93.93% higher than the initial amount of glutathione。醸造所の最適な培養時間' sの酵母細胞は24時間であったが、これは醸造所の成長変化を測定することによって決定された' s酵母。

（2）Through the one-way optimization of glycine, glutamic acid and cysteine, the three precursor amino acids were finally determined to be added at a concentration of 9.0 mmol/L to 15 mmol/L for Gly, 3.0 mmol/L to 9.0 mmol/L for Glu and 2.0 mmol/L to 6.0 mmol/L for Cys, and based on this, the optimum process conditions were obtained by using the Response Surface Design method to further optimize the three main factors Gly concentration, Glu concentration and Cys concentration. On this basis, the three main factors Gly concentration, Glu concentration and Cys concentration were further optimized using response surface design to obtain the optimal process conditions: glycine concentration of 12.64 mmol/L, glutamic acid concentration of 6.30 mmol/L, cysteine concentration of 3.72 mmol/L, and the total amount of glutathione obtained under these conditions was 315.65 mg/L. Compared with the optimal process conditions, the total amount of glutathione obtained under the optimal process conditions was 315.65 mg/L. The total amount of glutathione was increased by 58.92% compared with the optimal conditions and 208.19% compared with the initial amount of glutathione. By optimizing the addition time of precursor amino acids, it was determined that the addition time was the 21st hour after the incubation of brewer' s酵母。

(3)最後に醸造所の保存時間'sの酵母細胞を調べた。25日後、研究は、醸造所のグルタチオン産生、細胞内含有量および細胞バイオマスを示しました&#酵母は保存時間の延長、および醸造所のグルタチオン産生、細胞内含有量および細胞バイオマスの増加の割合で減少した' s酵母は前駆体アミノ酸の添加により減少したので、実験は、新鮮な醸造所後5日以内に行われるべきである'の酵母は、その生産を増加させるためにタンクから取り出した。したがって、実験は新鮮な醸造所の後5 d以内に行われるべきです' s酵母は、収量を増加させ、実験データの安定性を確保するためにタンクから取り出した。