ヒアルロン酸修飾と配合に関する研究

ヒアルロン酸(ha)は、酸性ムコ多糖のグループに属するグリコサミノグリカンの一種である。それは人体の様々な部分に広く分布しており、皮膚にも大量のヒアルロン酸が含まれています。1934年、米国のコロンビア大学のメイヤー教授が最初に行った隔離ヒアルロン酸牛のガラスのようなユーモアから[1]。体内においてヒアルロン酸は、タンパク質の調節、水や電解質の拡散・輸送の補助、関節の潤滑、血管壁の透過性の調節、創傷治癒の促進など、様々な重要な生理機能を示す多機能マトリックスです。最も重要なことは、ヒアルロン酸には特殊な保水効果があることです。現在、自然界に存在する最高の保湿物質であり、理想的な天然保湿因子(nmf)として知られています。(2%の純ヒアルロン酸水溶液が、98%の水分をしっかりと保持します。ヒアルロン酸は、そのユニークな物理的、化学的性質と生理学的機能により、医学および生物学的材料に広く使用されています。

のヒアルロン酸の化学構造カール・マイヤーによって解明されましたޞ年代の39;s研究室[1]。ヒアルロン酸はポリマーです。d-グルクロン酸とn-アセチルグルコサミンからなる高分子直鎖ムコ多糖である。D-glucuronic酸とN-acetylglucosamineはβが連なっている−1、3-glycosidic債券となり、二糖类はβが連なっているの単位−1、債券4-glycosidicです。分子中の2つの単糖は1:1モル比で構成されている。最大25,000個の二糖単位が存在する可能性がある。ヒトの体内では、ヒアルロン酸の分子量は5,000 ~ 2,000万ダルトンです[2,3]。ヒアルロン酸の構造式を図1に示します。

ヒアルロン酸は可溶性です水には溶けませんが、有機溶媒には溶けません。他の天然ムコ多糖と共通する多くの特性を有する。生体から抽出されたヒアルロン酸は、白色で無臭、吸湿性に優れています。塩化ナトリウム溶液中のヒアルロン酸は、グルクロン酸中のカルボキシル基によって解離し、h +を生成し、酸性のポリイオンアニオン状態となり、ヒアルロン酸に酸性ムコ多糖の性質を与えます[4,5]。ヒアルロン酸分子のヒドロキシ基は連続した配向で配列し、分子鎖上に疎水性領域を形成しているが、ヒアルロン酸分子鎖中の単糖間に水素結合が存在すると、空間的に剛直な円柱状のらせん構造になる[6]。カラムの内側に多数のヒドロキシ基が存在することで、ヒアルロン酸は非常に親水性が高くなります。したがって、ヒアルロン酸の親水性と疎水性は、1‰以下のヒアルロン酸が連続的な3次元ハニカムネットワーク構造を形成することを可能にする[5]。

水分子は内部に固定されていますヒアルロン酸ネットワークヒアルロン酸分子と極性および水素結合により、容易に失われません。研究によると、ヒアルロン酸は、その重さの約1000倍を水に吸着することができ、他の多糖類化合物とは比較になりません。したがって、ヒアルロン酸は、保水剤として、現在、自然界で発見された中で、水分を保持するのに最適な天然物質です。

ヒアルロン酸はタンパク質と結合しますゆるい結合組織の水分を維持するための重要な成分である、より高い分子量のプロテオグリカン分子を形成する。このゲル状のヒアルロン酸-タンパク質-水構造は、細胞を結合させ、組織の水分を保持しながら、正常な代謝機能を行うことを可能にします。また、ウイルスや細菌から細胞を守り、感染を防ぎ、皮膚にある程度の弾力と弾力を与えます[7、8]。

1ヒアルロン酸の調製方法

伝統的な方法はヒアルロン酸準備ヒトの臍帯、動物のガラス体、ニワトリなど、一般的に新鮮な動物組織である原料を使用した抽出方法です'櫛クジラの軟骨これらの原料は調達が困難で高価であり、これらの原料中のヒアルロン酸含有量は非常に低く、直接的には低収率につながります。さらに、抽出プロセスは複雑で、操作ユニットは面倒です。酵素や有機溶媒が大量に使用されており、不純物含有量が高いため精製が難しく、ヒアルロン酸のコストがある程度上昇します。そのため、抽出によって得られたヒアルロン酸は、拡大し続ける研究と応用のニーズを満たすことができません。ヒアルロン酸の新しい供給源を発見し、コストを削減するために、科学研究者たちは発酵法を用いてヒアルロン酸を生産し始めた[7]。

ヒアルロン酸を調製するための発酵方法は1970年代に遡ることができますが、それは大規模に開発されていません。日本の資生堂が、ストレプトコッカスを用いたヒアルロン酸製造法を初めて報告したのは1985年で、その後、ヒアルロン酸発酵法が大きく進歩しました。報告されているヒアルロン酸産生菌は、主にベルガーのストレプトコッカス属a、cである#39;sマニュアル、化膿連鎖球菌(グループa)、化膿連鎖球菌zooepidemicus(グループ200)、化膿連鎖球菌エクイ(グループc)、化膿連鎖球菌エクイグループc、化膿連鎖球菌agalactiaeグループc、およびクロストリジウムperfringensなど。a群は、主にヒトの病原体であるpyogenic streptococcusであり、生産株としては適していない。現在はほとんど使われていない。c群レンサ球菌はヒトの病原体ではなく、工業生産に比較的適している。近年では、ヒアルロン酸の工業生産海外ではすでに化膿レンサ球菌の使用が産業化されている。表1に抽出方法と発酵方法の主な違いを示します[7-9]。

抽出方法は、原料が異なり、抽出・精製工程も異なります[9]。例えば、鶏頭は低脂肪であり、高ヒアルロン酸含有。粉砕後、蒸留水で数回直接抽出するか、40 ~ 50°cに加熱して抽出する。0。47%の収率のヒアルロン酸溶液を得ることができる。ヒトの臍帯の場合、脂肪含有量は鶏の櫛よりも高い。60°cの希釈アルカリ溶液(ph =8)で数回抽出するか、水とクロロホルムの混合物(20:1/ w: w)で抽出し、同量のクロロホルムで洗浄してさらに脱度することができます。ヒアルロン酸の収率は0.2%である。硝子体液からのヒアルロン酸の抽出は、一般的にnacl溶液(0.1-1 m)を抽出液として使用し、収率は0.64-2.4%に達することができる。ピグスキンは脂肪を多く含み、硬くて粉砕しにくいため、一般的に37°cのnaoh溶液で一定期間液化した後、50%の酢酸で中和します。ヒアルロン酸の収率は約0.7%に達するが、精製プロセスは比較的複雑である。

のヒアルロン酸の品質発酵方法を使用して調製するには、主に次の4つの側面に依存:株の選択、培地のマッチング、発酵プロセスの最適化と分離精製プロセス。生物発酵法の長所は、原料に制約されず、工程が簡単でコストが安いこと。したがって、現在では発酵法がヒアルロン酸の製造に好まれています。ヒアルロン酸を作るための発酵法に使われている主な細菌は、zooepidemicus、equi streptococcus、equi-like streptococcusです。

発酵方法生産ヒアルロン酸有酸素発酵と無酸素発酵に分けられます。好気性発酵は収率が高く、高分子量のヒアルロン酸を生成します。発酵プロセス中、温度は通常37°cであり、ph値は6.0 ~ 8.5の範囲で制御する必要があります。酸やアルカリが多すぎる環境は、バクテリアの成長に影響を与え、ヒアルロン酸の収率を低下させます。ヒアルロン酸の収率を高めるために、異なる発酵段階で異なる酸素溶解速度を使用することもできます。さらに、発酵スープの粘度は、ヒアルロン酸の収率を直接反映することができます。ヒアルロン酸の擬塑性は、溶液の粘度を高いせん断速度で低下させる。撹拌速度が高いとヒアルロン酸の分子量が大幅に増加しますが、速度が高すぎると分子が破壊され、ヒアルロン酸の分子量が減少する可能性があります。したがって、攪拌速度は通常100 - 800 r/minで制御されます。ヒアルロン酸の収率は、ウラシル、グルタミン、アスパラガス酸を少量発酵スープに加えるか、またはリゾチームを加えることによって増加させることもできます[10-13]。

現在、国内でのhaの採取は、人のへその緒や鶏のくしなどを原料とする段階にある。上海大学は、豚の皮膚からヒアルロン酸を抽出する方法を報告している、とヒアルロン酸の分子量生産数は約106機。微生物発酵を利用してヒアルロン酸を生産する人もいます。収率は4.6 g/lと報告されていますが、分子量はわずか50万です。また、またγ-rays収量性を知るための磁場変異原優れる成绩书のみを注意深くヒアルロン酸。。[14]例えば、陳ヨンホ紫外线や60Co-γを使用を得て、-ray照射が変異を起こしnon-hemolyticの変種ウィルスバクテリアNC1150石高をを増やしたうえで相対分子量します!

2生体材料としてのヒアルロン酸特性の改善

純粋なヒアルロン酸水に溶けやすい、吸収が早い、組織内での滞留時間が短い、機械的特性が悪いなどの欠点があり、材料の硬度や機械的強度を必要とする場面では使用できない。ヒアルロン酸が生体材料の分野でより広く使用されるようにするためには、その特性を最適化し、適用範囲を広げるために化学的に改変する必要があります。ヒアルロン酸の機械的特性を改善し、その分解速度を制御するために、ヒアルロン酸は化学的に修飾されたり、架橋されたりすることができます。ヒアルロン酸は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アセタミド基などの官能基を持ち、架橋、エステル化、グラフト、分子修飾および配合によって修飾することができます。化学的に修飾されたヒアルロン酸は、カルボン酸やアルコールの主な性質を明らかに持っています。カルボン酸およびアルコールはエステル化によって修飾され、ジチオトレイトールまたはジスルフィドといったヒドラジン化合物と結合する[3,6]。修飾後のヒアルロン酸は、本来の生体適合性を維持しながら、機械的強度、粘弾性、レオロジー特性、ヒアルロニダーゼ分解に対する耐性といった一連の優れた特性を有しています。

2.1 .ヒアルロン酸とポリエチレングリコールの共有結合性架橋

現在の研究では、架橋したヒアルロン酸ゲルの機械的性質と分解速度は、架橋の度合いと架橋分子の分子量によって制御できることが示されている。ヒアルロン酸は様々な架橋度でポリエチレングリコールジアミンと共有架橋することができる。架橋分子としてポリエチレングリコールが選ばれたのは、それが生体適合性があり親水性があるからである。pegは水溶液に可溶で、さまざまな分子量で市販されています。ゲルの弾性特性は変形可能なpeg鎖によって保証され、機械的特性は構造的に保証されます安定なヒアルロン酸鎖.

架橋の程度がヒアルロン酸ゲルの機械的性質と分解挙動に及ぼす影響が研究されている。ヒアルロン酸ゲルは、共有結合性架橋ヒアルロン酸と2つの異なる分子量のポリエチレングリコールから、様々な架橋度で調製されます。実験は、架橋の理論的な程度として示されているヒアルロン酸ジェル0から20%に増加すると、弾性率は徐々に増加します。しかし、理論架橋度が20%以上になると弾性率は低下しました。理論架橋度が20%のとき、弾性率が増加し、架橋分子の分子量が減少しました。理論的な架橋度が20%である場合、でvitroでのヒアルロン酸ゲルの分解率は架橋分子の分子量の減少とともに低下した。理論的な架橋度が0から20%に上昇すると、架橋されたヒアルロン酸の分解速度は低下します。しかし、理論架橋度が30%以上上昇した場合、劣化率に有意な差は見られなかった[15,16]。制御された機械的特性と分解速度に関する詳細な研究を通じて、ヒアルロン酸ゲルのさらなる開発は、医療および生物学的材料の幅広い用途を提供するでしょう。

ヒアルロン酸異なる分子量のポリエチレングリコールのジアミンに共有結合することによって修飾される。架橋したヒアルロン酸ゲルの機械的特性と分解速度は、架橋分子の分子量と架橋度を変えることによって制御することができます。架橋ヒアルロン酸ゲルは制御可能な機械的特性と分解速度を有しており、細胞移植や薬物送達のような幅広い生物医学的応用を可能にしている。

2.2ヒアルロン酸とポリヒドラジド化合物の架橋

ヒアルロン酸は架橋することができます異なるヒドラジド化合物と異なる架橋条件で異なる物理化学的特性を有するゲルを得ることができます。ヒドラジド架橋剤は、ゲルにヒアルロニダーゼに対する耐性を持たせる。実験では、ゲルの分解は架橋剤の濃度に依存しないことが示されており、分解はゲルの界面でのみ起こることが示されています。酸性媒体中のヒアルロン酸ゲルの安定性とph >での遅い溶解;7.0はアルカリ性環境での薬物送達の制御における潜在的な役割を示している[15 - 17]。

ヒドラジド化合物は架橋剤として用いられる修正ヒアルロン酸より機械的に硬く脆いゲルにハイドロゲル。ヒアルロン酸は、大量のアジピック・ジヒドラジドの存在下で、安定なhaアジポイルジヒドラジド(ha-adh)誘導体になることができる[18]。paul bulpitt[19]らは、ヒドラジド化合物によるヒアルロン酸の化学修飾が、加水分解に抵抗があり、再配置活性がないエステル中間体を形成できることを示した。haヒドラジドやhaアミドなどの生体適合性の良い新しいハイドロゲルが合成されており、徐放薬の効果を得るためにある程度水溶性を低下させている[20]。

2.3ジスルフィドと架橋したヒアルロン酸

ヒアルロン酸はジスルフィドと架橋することができる。例えば、ヒドラジノリシスの一定量3,3'-ジチオプロピオン酸(dtp)をヒアルロン酸水溶液に加えることができ、反応溶液のphはhclとnaohを用いて酸から塩基へと調整することができる。この過程で固体カルボジイミド(edc)を添加し、最終的に分離、凍結乾燥、精製を行い、メルカプトを得ることができますヒアルロン酸派生(HA-DTPH)[20]。

実験により、ジスルフィド架橋が示されたmercapto-hyaluronic酸派生(ha-dtph)ゲルはin vivoでもin vitroでもゆっくりと分解するが、ジスルフィド架橋の度合いを変えることで分解速度を制御することができる。同時に、ヒアルロン酸ゲルは、創傷治癒や組織修復の臨床応用の可能性を秘めています[21]。

2.4ヒアルロン酸エステル化

Carboxylエステル化

のヒアルロン酸のカルボキシル基脂肪族アルコールまたは芳香族アルコールとエステル化し、エステル化誘導体を形成することができる[21]。エステル化後、haの溶液レオロジー特性は著しく改善され、弱いコロイド状のネットワーク構造を形成する。エステル化の度合いが増すにつれて、ヒアルロン酸エステル化誘導体の溶解度は低下し、高エステル化誘導体は水に不溶です。また、エステル化の程度が分解速度に大きく影響します。これは、完全にエステル化された物質の疎水性の断片がポリマー鎖のネットワークをより堅く安定化させ、酵素による分解を受けにくくするためと考えられる。部分的にエステル化された物質は、より変形しやすく、水とより容易に結合します。

ヒアルロン酸エステル化誘導体いくつかの従来のプロセス方法を使用してフィルムや繊維にすることができます,スポンジに凍結乾燥したり、スプレー、乾燥、抽出、蒸発によって微小球に調製し、制御薬剤放出のためのキャリア材料として使用することができます。さらに、この種のヒアルロン酸エステル化誘導体は、人工皮膚や人工軟骨の開発、間葉系幹細胞の培養、抗生物学的、抗腐食の目的にも使用できます[20]。

Hydroxyesterification

無水物酪酸と低分子ヒアルロン酸のトリメチルピリジン塩をジメチルアミノピリミジンを含むジメチルホルムアミド(dmf)に反応させると、酪酸が結合するヒアルロン酸。酪酸は細胞分化を誘導し、腫瘍細胞の増殖を阻害するので、ヒアルロン酸酪酸は新しい標的薬物送達システム材料として利用できる。

内部エステル化

内部エステル化ヒアルロン酸派生商品ヒアルロン酸のヒドロキシル基とカルボキシル基の間の分子内および分子間結合によって達成される。pressato[22]とbelini[23]らは、ヒアルロン酸のジメチルスルホキシド(dmso)溶液をトリエチルアミンで前処理し、ヒアルロン酸を[r4n] + haに変換した。2-クロロ- 1-メチルオドピリジンは架橋剤として用いられ、ヒアルロン酸の内部エステル化を引き起こし、分子内および分子間エステル化の両方でhaラクトン誘導体を生じる。この方法は、腹部手術や産婦人科の手術後の癒着を減らす手術に使用できます。ヒアルロン酸の内部エステル化誘導体は、組織の損傷修復や軟骨や骨の再生のための足場としても使用できます。

2.5移植修正

ヒアルロン酸天然高分子や合成高分子に架橋剤を用いて接木することで、生体力学的性質や物理化学的性質を変化させた新しい材料を形成することができる[20]。

このプロセスを図2に示します。haはまた、図3に示すように、リポソームの表面にグラフトされ、標的と遮蔽の効果を与えることができる。

後ヒアルロン酸が修飾されますジヒドラジドがha-adh誘導体を形成すると、薬剤分子をha-adhに結合させて、ha結合薬を形成することができます。ヒアルロン酸は、新しい薬物標的と制御された放出を提供することができます。一般的なプロセスは以下の通り:ジヒドラジドがhaに結合した後、残りのヒドラジドnh2がha分子中の他のカルボキシル基と再結合し、分子内または分子間架橋が起こる。同時に、残りのnh2を薬剤の活性部位に接続してヒアルロン酸に結合させるか、薬剤をまずポリヒドラジドに接続し、次にha分子にグラフトしてヒアルロン酸結合した薬剤系を得る。その構造を図4に示します。

2.6合成修正

ヒアルロン酸は非抗原性分子ですそれは炎症や免疫応答を引き起こすことなく、他の材料と組み合わせて使用することができます。例えば、ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの主要な構造タンパク質であるコラーゲン[20]と組み合わせることができます。ヒアルロン酸とコラーゲンの組み合わせは、優れた機械的特性を与えます。ヒアルロン酸はキトサン(cs)とゼラチン[20]と組み合わせることもでき、csゲル- ha複合材料(キトサン-ゼラチン-ヒアルロン酸)を形成する。この複合材料は、効果的に細胞の材料表面への接着性を向上させることができ、材料表面上の細胞の生存率を高め、できるだけ早く正常な成長と増殖サイクルに入ることができます。ヒアルロン酸はまた、ポリ(ラクチド-グリコライド)(pla / plga)のような合成ポリマーと合成することもできます。ポリ(lactide-co-glycolide) (pla / plga)は、毒性がなく、完全に生分解可能な合成ポリマーで、処理が容易で、分解性があり、制御可能な分解速度を持っています。plaまたはplgaをhaにブレンドすることで[24]、haの分解速度を低下させ、haが組織内に残る時間を延長することができる。

3生体材料の分野におけるヒアルロン酸の応用

ヒアルロン酸派生商品 修飾によって得られた特定の特性を必要に応じて向上させることができ、生体材料の分野におけるヒアルロン酸の応用を大幅に拡大します。現在、ヒアルロン酸またはその誘導体は、外科的抗接着、関節炎治療、眼科疾患治療、局所薬物送達キャリア、組織工学など、様々な分野で使用されている[25-29]。様々な修飾ヒアルロン酸製品の応用例を表2に示します。

4結論

この論文ではヒアルロン酸の調製方法ヒアルロン酸の修飾と配合です現在、ヒアルロン酸の調製、修飾、配合に関する研究は、喜ばしい進歩を遂げていますが、臨床応用に使えるようになるまでには、まだ長い道のりがあります。さらに、ヒアルロン酸は、高い粘弾性、可塑性、浸透性、独特のレオロジー特性を持ち、生体適合性に優れた生体吸収性素材です。保湿性が高く生体適合性に優れているため、バイオメディカル用途の重要な原料となっています。眼科、整形外科で広く使用されており、外科、小児科、神経科などの分野にも適用されています。また、ヒアルロン酸は副作用なく術後の接着を効果的に防ぐことができます。また、薬物放出担体としても使用でき、人気のある新しい生物医学材料です。しかしながら、ヒアルロン酸には、その機械的強度やヒアルロニダーゼ分解に対する耐性などを向上させるために、様々な化学修飾によって補わなければならない欠点もあります。一般的な修飾方法には、架橋、エステル化、グラフト、分子修飾、コンパウンドなどがあります。そのため、ヒアルロン酸の詳細な研究は続けられています。現在の研究は、ヒアルロン酸ゲルの特性を改善し、よりスマートにすることに焦点を当てています。

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