発酵法によるヒアルロン酸粉末の製造方法?

ヒアルロン酸(HA)1934年にmeyerらによって牛の硝子体液から初めて単離され精製された高分子多糖類で、別名ヒアルロン酸[1]である。ヒアルロン酸はhomogeneously反復線形グルコサミン多糖類、2000を用いて構成されて約2万5000 disaccharides N-acetylglucosamineとグルクロン酸は交互にβに缚られ−1、3 glycosidic債券(外平債)やβ−1、4 glycosidic債券いる[2]。

ヒアルロン酸は、細胞外マトリックス(ecm)の重要な構成要素です[1]。最近の研究で、ヒアルロン酸は細胞間の細胞外マトリックスに広く存在するだけでなく、新生細胞の細胞質と核に主に集中して細胞内にも存在することが示されている[2]。ヒアルロン酸は、硝子体だけでなく、関節の滑液や表皮細胞の間にも豊富に存在しています。量で見ると、ヒアルロン酸の50%以上は皮膚の真皮と表皮にあり、35%は筋肉と骨にあります。現在ではそう信じられているヒアルロン酸主に軟質結合組織の不活性空間充填剤に見出され、プロテオグリカン複合体の形成に重要な役割を果たしている[2]。

1ヒアルロン酸の性質

電子顕微鏡で観察するとヒアルロン酸分子水溶液中では、直線状の単鎖構造を持ち、コイル直径約500 nmのランダムなコイル構造に膨張することが観察された。ヒアルロン酸分子の各二糖ユニットにはカルボキシル基が含まれており、これは生理学的条件下で解離してアニオンを形成することができます。空間距離が等しいアニオン間の相互反発により、水溶液中では分子は自由に伸びた状態となり、空間を占有するため、水中では自身の1000倍以上の重さのアニオンと結合する[3]。

ソースに応じてとヒアルロン酸抽出法分子量は8×105 ~ 5×106[4]。ヒアルロン酸の構造と生物学的活性は、その相対分子量に依存します。低分子ヒアルロン酸は、低濃度では断片的なネットワークを形成しますが、高分子ヒアルロン酸は完全なネットワークを形成します[3]。

分子内の水素結合のためにヒアルロン酸分子水溶液中で単らせん構造をとる[5]。溶液中のヒアルロン酸濃度が一定のレベルに達すると、ヒアルロン酸分子は相互作用して二重らせん構造を形成し、より高い濃度でネットワーク構造を形成する[3]。現在受け入れられているヒアルロン酸構造理論は、第三次構造理論であり、ヒアルロン酸分子の各三糖ユニットは疎水性領域を持っているというものです。溶液濃度が高いと、ヒアルロン酸分子の疎水性領域は相互作用して二重らせん構造を形成し、これがヒアルロン酸分子の凝集の基礎となっている[6]。

ヒアルロン酸非常に高い粘度が特徴です[2]。相対した低浓度または低分子の質量、粘度の増加している集中と小さな変化による解又は粘性到達10が后mPa・s氏と集中が増えるにつれてするヒアルロン酸分子を始めると、その时氏粘性が増し急増しといると集中[3]。

2ヒアルロン酸粉末の製造技術

ヒアルロン酸粉末の製造技術は、抽出、微生物発酵、合成の3つが報告されている[1]。

抽出方法にはヒアルロン酸を抽出するヒトや動物の組織から得られます[1]。この抽出法は、ヒアルロン酸の製造に用いられた最初の方法であった。現在、生産に使用される主な原料は、鶏の櫛、人のへその緒、動物の目です。主なプロセスステップには、抽出、不純物除去、酵素加水分解、沈殿、分離が含まれます。組織によってヒアルロン酸の抽出と精製のプロセスはある程度異なります[3]。しかし、原料の供給源が限られているため、製品の抽出率が非常に低く(1%前後)、工程も複雑で、生産コストを下げることは難しい。また、動物組織ではヒアルロン酸が他の高分子物質と結合しているため、分離や浄化が難しく、動物組織から抽出されたヒアルロン酸製品が感染の原因になる可能性があります。これらの要因により、抽出法は医療や化粧品などの業界で広く適用されていません[2,3]。

合成方法は、最初に「a」を合成することを含む。ヒアルロン酸オキサジリジン誘導体「生体高分子を使い、羊や牛の精巣から水とヒアルロニダーゼを加えて、誘導体と酵素の複合体を作り、最後に酵素を除去してヒアルロン酸を浄化します[1]。この合成法はまだ実験室での研究段階にあり、工業生産にはまだ適用されていません[1]。

微生物発酵法とは、選別した細菌を用いて発酵と培養を行い、それを発酵スープから分離・精製してヒアルロン酸生成物を得ます[1]。このような抽出法の欠点と、合成法が未成熟であることから、微生物発酵法が最も重要な方法となっている生産ヒアルロン酸。以下は、ヒアルロン酸粉末を製造するための微生物発酵法のより体系的な概要です。

2.1ヒアルロン酸産生細菌の繁殖

最初に発見された微生物生産ヒアルロン酸1937年に発見されたstreptococcus pyogenesは、ヒアルロン酸を産生することができた[7]。その後、1939年にはstreptococcus equisimilisとs . zooepidemicusもヒアルロン酸を産生することが発見された[7]。野生型連鎖球菌はヒアルロン酸を産生するので  equisimilisやstreptococcus zooepidemicus (s . zooepidemicus)もヒアルロン酸を産生することがわかった[7]。

野生型のストレプトコッカス菌は、ヒアルロニダーゼを産生する能力、他の細胞外タンパク質を発現する能力、などの欠点を持っているので低ヒアルロン酸生産[2]、野生株は、実際の生産において、産業生産のニーズに応じて様々な方法で改変する必要があります。

2.1.1変異原繁殖

変異原には主に物理変異原、化学変異原、生物変異原がある。現時点では、の繁殖に使用される変異原ヒアルロンacid-producing株主なもの紫外線、60Coγ线とnitroguanidine (NTG)【7】。多くの研究報告書をがいくらかの治療によって示す独創のが発声できるヒアルロン酸が連鎖状球菌等身連鎖状球菌zooepidemicusなど様々なmutagenic治療卓越した株が高額ヒアルロン酸生産、または高い分子量ヒアルロン酸否定的な反応の注文hyaluronidaseとnon-hemolysisや両方の組合せ前記の特質に加えてさらに【7】取得することができる。

2.1.2原形質体文化

プロトプラストは細胞壁を持たないため、通常の細胞よりも環境条件の変化に敏感であり、変異原性治療に対してより強く反応する[7]。ntgなどの化学的変異原やレーザーなどの物理的変異原を用いて、原株の原細胞を治療し、高収量株を得る実験が成功している[7]。

2.1.3遺伝子工学育種

関与する酵素をコードする遺伝子ヒアルロン酸合成連鎖球菌の経路は1つの逆転写酵素上にあり、hasオペロンと呼ばれている。streptococcus pyogenesでは、hasオペロンは3つの遺伝子から構成されている:ha合成酵素(42.0 u)をコードするhasa (1248 bp)、udp-glucose dehydrogenase (47.0 u)をコードするhasb (1204 bp)、udp-glucose pyrophosphorylase (33.7 u)をコードするhasc (915 bp)[2]。ヒアルロン酸鎖が細胞膜を通ってどのように輸送されるのかはまだ明らかではないが、enterococcus faecalis、escherichia coli、bacillus subtilisにおけるヒアルロン酸合成酵素とudp-グルコース脱水素酵素の発現は、ヒアルロン酸の生産と輸送を誘導するのに十分である[2]。したがって、hasaとhasb遺伝子を宿主細胞に移植し、宿主細胞内で発現させるだけでヒアルロン酸を生成することができる[7]。

streptococcus agalactiae group aのmucoid gas株s 43/192/4のha合成遺伝子は、1993年に最初にクローン・構築され、大腸菌のプラスミドになり、大腸菌でha合成に成功した[8]。その後、streptococcus agalactiae group cのha合成遺伝子がクローンされ、1997年に大腸菌で発現した[8]。

ling minら[9]は、streptococcus equi subspの全dnaからsqhas遺伝子を増幅した。zooepidemicus、表現plasmid大腸菌な形にDH5α、sqHASタンパク質を表明しており、合成されたHAれ基板上の存在に関する。zhang jinyuら[10]は、streptococcus zooepidemicusのhasb遺伝子をクローニングし、それを大腸菌で発現させて対応するタンパク質を得た。

中国台湾省のchien研究グループは、ナイス誘導発現系を介して、streptococcus zooepidemicusのhasa遺伝子とhasb遺伝子をlactococcus lactisに導入し、その遺伝子改変株を得ることに成功したヒアルロン酸生成[11]。

sheng juyu[12]は、streptococcus zooepidemicusのヒアルロン酸合成酵素遺伝子を、nice (nisin-controlled gene expression system)誘導性発現系を介してlactococcus lactisに導入し、ha合成に成功した。

2.2発酵条件の最適化

レンサ球菌は、栄養価の高い培地で生育する必要のある、栄養要件の厳しい細菌である。レンサ球菌は通常、酵母または動物抽出物、ペプトンおよび血清の混合物を含む複雑な培地上で生育する。これらの媒体の組成は、常にグルコース(10 - 60 g/ l)、アミノ酸、ヌクレオチド、大量の塩、微量ミネラルおよびビタミンを含みます[2]。

phと温度は、連鎖球菌zooepidemicusとの成長に非常に重要ですヒアルロン酸の生産。いくつかの研究では、ph 6.7±0.2と温度37°cの条件が、遊菌連鎖球菌の成長とヒアルロン酸の生成に最も適していることが示されている[13]。撹拌速度もヒアルロン酸の生成に影響します。研究によると、撹拌速度が低い条件下では、乳酸産生は高く、ヒアルロン酸産生は低い[13]。高速撹拌は、乳酸合成の効果を低下させ、ヒアルロン酸産生を増加させることができるが、同時にヒアルロン酸ポリマーを破壊し、その相対分子量を減少させることもできる[13]。最初のグルコース濃度は、ヒアルロン酸の相対分子量に大きな影響を与えます。研究によると、最初のグルコース濃度を20 g/ lから40 g/ lに上げると、ヒアルロン酸の相対分子量も(2.1±0.1)×106から(3.1±0.1)×106に増加する[13]。

liuらは、遊菌ストレプトコッカスのバッチ発酵中に、8時間で過酸化水素(1.0 mmol/g ha)を、12時間でアスコルビン酸(0.5 mmol/g ha)を添加して酸化還元を起こすことを報告した[14]ヒアルロン酸の脱重合その結果、相対分子量が減少し、収率が5.0 g/ lから6.5 g/ lに増加した。

3ヒアルロン酸の応用

多くの人々がヒアルロン酸の特性上記のように、多くの分野で広く使用されています。以下は、主に化粧品、健康製品、医療・製薬分野におけるヒアルロン酸の応用をまとめたものです。

3.1化粧品におけるヒアルロン酸の応用

ヒアルロン酸主に細胞間の細胞外マトリックスで発見され、ここでは、組織細胞の細胞外空間を維持し、栄養素の流れを加速し、組織を維持する機能を持っています。まず、従来の保湿剤に比べて、ヒアルロン酸は保湿効果が高く、べたつかず、毛穴を詰まらせないというメリットがあります。第二に、ヒアルロン酸水溶液は強い粘弾性と潤滑性を持ち、肌表面に通気性の高い保湿膜を形成し、肌の保湿を維持します。第三に、ヒアルロン酸の低分子は、真皮に入ることができ、血液の微小循環を促進し、皮膚が栄養素を吸収するのを助け、美容と健康増進の効果があります。最後に、ヒアルロン酸は紫外線によって引き起こされる皮膚の活性酸素フリーラジカルを除去し、太陽からの保護と修復を提供します[15]。

多くの人々がヒアルロン酸の利点保湿、エモリエンス、シワ防止、日焼け止めに最適な天然保湿因子として化粧品に広く使用されています。通常の添加量は0.05% ~ 0.50%である[15]。

3.2健康製品におけるヒアルロン酸の応用

からヒアルロン酸には様々な性質があります水分保持、潤滑、創傷治癒促進、細胞保護など、体内のヒアルロン酸の減少は、関節炎、皮膚の老化、シワの増加など、多くの問題を引き起こす可能性があります。したがって、内因性ヒアルロン酸を補うためのヒアルロン酸の経口補給は、美容と健康を維持し長寿命を延長する有効な方法の一つと考えられています[16]。

その理論的根拠は口頭ヒアルロン酸経口消化後、ヒアルロン酸が体内でヒアルロン酸を合成するための前駆体を増やし、体内で合成されるヒアルロン酸の量を増やし、皮膚などの組織に作用させることができる。現在、錠剤、カプセル、口腔液など、さまざまな口腔ヒアルロン酸製品が発売されています[16]。

3.3医療におけるヒアルロン酸の応用

ヒアルロン酸が広く使用されていますその独特の粘弾性、生体適合性、非免疫原性により、眼科、整形外科、その他多くの医療分野で使用されています[17]。

眼疾患の場合、優先的な治療経路は眼の局所投与である。眼科薬の場合、薬剤の生物学的利用能は一定範囲内の液体の粘度と正の相関がある。粘度を上げると、目の中の薬剤の滞留時間が長くなり、効果が向上します。しかし、いくつかの粘度増強剤は、目の不快感などの副作用を引き起こす可能性があります。ヒアルロン酸は、非ニュートン流体の特性と優れた生体適合性により、この欠点を克服します。したがって、開発および適用する価値のある優れた眼科薬粘度剤である[18]。ヒアルロン酸は目薬に使用されるだけでなく、ドライアイの症状の治療にも使用できます。現在、ヒアルロン酸は、ドライアイの症状を改善するために、他の様々な高分子ポリマーと一緒に使用されています[19]。

ヒアルロン酸は、硝子体に存在するだけでなく、関節軟骨や滑液の主要成分でもあります。変形性関節症、関節リウマチなどの関節疾患を発症すると、関節内のヒアルロン酸産生と代謝に異常が生じ、滑膜液中のヒアルロン酸濃度と相対分子量が著しく低下し、軟骨の分解を妨げる。これにより、関節疾患を治療する粘弾性補完療法が開発されました外因性ヒアルロン酸を補う。この治療法は、長期にわたる有効性とわずかな副作用のため、医師と患者の両方からますます人気が高まっています[20]。

さらにヒアルロン酸は、様々な担体(抗腫瘍標的薬担体、遺伝子治療のための非ウイルス性ベクター、担体など)として、ドラッグデリバリーシステムにおいても広く使用されていますペプチド手術や再発性口腔潰瘍の治療におけるインプラント材料として[17]。

4展望

ヒアルロン酸は様々な分野で応用されつつあり、微生物発酵法が生産されていますヒアルロン酸粉抽出法に代わって、ヒアルロン酸工業生産の主要な方法になりつつある。外来でのヒアルロン酸生産の始まりは、ヒアルロン酸の生産が現代のバイオテクノロジーを応用する段階に入ったことを示しています。今後は、相対分子量の異なるヒアルロン酸を生産できる菌株を選択し、継続的に発酵条件を最適化することで、様々な分野で使用できるヒアルロン酸製品を提供する。ヒアルロン酸はまた、多くの分野でますます広く使用されるでしょう。

参照:

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