低分子量ヒアルロン酸粉末の調製方法は何ですか?

ヒアルロン酸グラス酸(glass acid)は、グルクロン酸(glcua)とn-アセチルグルコサミン(glcnac)からなるグリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、無臭で無味な白色粉末です。水には溶けるが、有機溶媒には不溶である。分子量(mr)は1×104から7×106である。良好な粘弾性と擬塑性レオロジーを有し、眼科微細手術、関節炎治療、組織工学、外科的接着防止などの分野で広く使用されている[1]。ヒアルロン酸は組織抽出と微生物発酵によって生成されます。異なるヒアルロン酸は構造に違いはありませんが、mr値が異なるヒアルロン酸は、明らかにmr依存性で、異なる、あるいは逆の生物学的活性を示します。

分子量のヒアルロン酸の>2×106は、眼科手術で、その良好な粘弾性特性のための変形性関節症の治療のために使用されます;分子量(1 - 2)×106のヒアルロン酸は、その優れた保湿特性から、目薬や化粧品に使われている。mr .(1 ~ 8)×104低相対分子ヒアルロン酸(低分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸)とmr . <1×104ヒアルロン酸オリゴ糖は、血管新生や創傷治癒、抗腫瘍などの生物学的活性を持っています[2]。低分子ヒアルロン酸の調製方法と生物学的活性に関する最新の研究をレビューします。

1低分子ヒアルロン酸の調製方法

のヒアルロン酸の分子量動物組織からの抽出と分離または微生物発酵によって生産され、一般的に2×105から7×106である。しかし、現在のところ低分子ヒアルロン酸の分子量について統一された基準はなく、一般的に1×104から5×105と考えられています。そのため、ヒアルロン酸をある程度分解した後、それを精製、精製することで、低分子ヒアルロン酸パウダーを作ることができます。分解には多くの方法があり、物理的な分解方法、化学的な分解方法、生物学的な分解方法に分けることができます。また、微生物発酵によって低分子ヒアルロン酸も生成することができます。劣化方法にはそれぞれ長所と短所があり、実際のニーズに応じて適切な劣化方法を選択することができます。

1. 1物理劣化法

物理的な劣化方法は、物理的な要因を使用します退化ヒアルロン酸熱、機械せん断、紫外線、マイクロ波、超音波、ガンマ線照射など。choiら[3]は、電子線照射(eb)、ガンマ線照射(gm)、マイクロ波照射(mw)、熱処理(th)によるヒアルロン酸粉末の分解効果を比較した。その結果、4つの方法はいずれもヒアルロン酸mrを1.04×106から2×105、3×105に分解することができたが、いずれも分解後の低分子ヒアルロン酸の構造に影響を与えた。中でも、mw処理法は265 nmの低分子ヒアルロン酸の紫外線吸収を増加させ、分子構造に二重結合を生じさせ、製品の色を茶色に変えます。しかし、この方法は低分子ヒアルロン酸の抗酸化活性を高める可能性があります。

eb法とgm法は、uvスペクトルへの変化を最小限に抑えます低分子ヒアルロン酸他の方法と比較して、分解時の分子構造変化が少ないことを示します。しかし、得られた生成物は低多分散性(mw / mnはそれぞれ2.21と2.27)であり、eb法とgm法のヒアルロン酸分解はmw法よりもランダムです。thは、ヒアルロン酸分解の簡単でコントロールしやすい方法です。ヒアルロン酸粉末を90°cのオーブンに52時間入れ、狭いmr分布範囲の製品を得ます。物理分解法は、化学試薬を必要とせず、環境を汚染せず、後処理が簡単で、分子量分布が狭く、熱安定性に優れた製品を得ることができます。しかし、この方法では分解に時間がかかり、大量生産には向いていません。生産コストを削減するために、化学分解法が主に使用されます。

1. 2化学分解法

いくつかの化学試薬は、破壊するために使用することができますヒアルロン酸チェーンそれによって劣化の目的を達成する。酸加水分解には塩酸が、アルカリ加水分解には水酸化ナトリウムが、酸化分解には次亜塩素酸ナトリウムと過酸化水素が用いられる。酸化的分解の主な原理は、酸化剤によって生成された酸素ラジカルがヒアルロン酸鎖のグリコシド結合を破壊することです。h2 o2の濃度が高いほど、分解が速くなります。cucl2を添加すると、劣化速度が著しく向上する[4]。さらに、weissberger&でヒアルロン酸が酸化的に分解されることも発見されています#39;s系[アスコルビン酸+ cu (ii)]ですが、d-ペニシラミンや還元されたグルタチオンのようないくつかのメルカプト化合物の添加は、ヒアルロン酸の分解を阻害することができます[5]。

従来の化学分解法に加えて、近年、guら[6]は電気化学を研究しているヒアルロン酸の分解すなわち、ti / tio2 - ruo2電極を使用して、ヒアルロン酸溶液(0.1% w / v)を電気分解プロセス中に均一に攪拌し、温度を50°cに制御します。その結果、ヒアルロン酸のmrは120分以内に1.49×106から6.9×104に減少することができた。このように、電気化学的手法は、分解時間が短く、簡便で実現可能であり、応用の可能性が高い新しい手法です。化学分解法では、添加する化学試薬の量や反応時間を制御することで、生成物のmrを制御することができます。分解時間が短く、生産コストを削減できます。しかし、反応条件が比較的厳しいため、糖鎖上のグリコシド結合が破壊されるだけでなく、単糖残基の構造が破壊される可能性がある。また、製品に酸化剤の残留物があり、製品の品質を低下させる可能性があります。

1. 3分解前記

ヒアルロン酸は分解されます動作hyaluronidase(ヒアルロニダーゼ、ヒアルロン酸as)、グリコシド結合を破壊する。過去には、ヒアルロニダーゼはほとんどが動物の精巣に由来していた。annal—isaら[7]は、ウシの精巣ヒアルロニダーゼ(bth)をでvitroでヒアルロン酸を加水分解し、bthがヒアルロン酸のmrを有意に減少させることを発見した。酵素濃度が高く、時間が長いほど、ヒアルロン酸鎖は短くなります。実験結果によると、bth 10 u・ml-1による24時間の酵素加水分解後、ヒアルロン酸のmrは1×104まで低くなることがあります。cui xiangzhenらは[8]、基質濃度10 g・l-1、酵素濃度15万u・l-1、ph 5.0、反応温度50°cのヒアルロニダーゼ触媒によるヒアルロン酸加水分解の最適条件を決定した。反応時間を制御することで、mrの異なるヒアルロン酸を得ることができます。しかしながら、動物の精巣からヒアルロン酸を得る方法は、原料によって制限されており、比較的高価です。ある種の連鎖球菌がヒアルロン酸asを産生することがわかっています。

ei-saforyら[9]は、hのasを産生する細菌の種類をまとめた。例えば、agalactiae streptococcus、pyogenes streptococcus、肺炎streptococcus intermedium、consellatus streptococcus、dysgalactiae streptococcus、uberis streptococcus、zooepidemicusなどである。これらのレンサ球菌は、n-アセチルグルコサミン結合を切断し、非分解端に-4,5-アルドン酸残基を生成することによってヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼを産生する。ヒアルロニダーゼに加えて、グルクロニダーゼとヘキソサミニダーゼにも効果がある分解ヒアルロン酸[10]。

酵素加水分解は最も穏やかな分解方法であり、最も影響が少ないヒアルロン酸の構造それゆえに、その活動。低分子ヒアルロン酸の調製に使用され、ジェルクロマトグラフィー分離後もヒアルロン酸オリゴ糖が得られる。しかし、ヒアルロン酸の供給源は限られており、高価であるため、その用途はかなり制限されています。

1. 4微生物発酵

準備のための上記の方法low-molecular-weightヒアルロン酸この分解は複雑で時間がかかり、一部のヒアルロン酸も分解過程で失われます。近年、低分子ヒアルロン酸は、主に菌株や培地の組成を変えたり、発酵過程で特定の物質を添加したりすることによって、発酵培養によって直接製造できることが研究によって示されています。米国特許[11]によると、組換え菌枯草菌は、温度を変えた培養条件下で、2×104 ~ 8×104の低分子ヒアルロン酸を生成することができると報告されています。この方法は、株の生育に適した温度で一定期間培養した後、温度を上げて低分子ヒアルロン酸を作るという目的を達成します。

piresら[12]は、streptococcus zooepidemicus発酵用培地を改良した生産ヒアルロン酸。培地には大豆タンパク質の加水分解物、濃縮ホエイタンパク質、カシューナッツ液などの農産物誘導体を用い、制御にはブドウ糖を炭素源、酵母抽出物を窒素源とする合成培地を用いた。媒体はボトル震えるに孵化37°C150 r・min-1 24 hした結果、平均全部生産され消費されるヒアルロン酸さんとして農産物培地の人口を103 ~ 104、そのうち生産され消費される低分子ヒアルロン酸やカシューナッツ氏液体媒体時間は約2×104。

liuら[13]発酵8時間と12時間で増殖連鎖球菌streptococcus zooepidemicusの発酵培養液に過酸化水素(1.0 mmol・g-1ヒアルロン酸)とアスコルビン酸(0.5 mmol・g-1ヒアルロン酸)を加え、酸化分解を用いて最終的な発酵液を得たヒアルロン酸の製品mrは8×104。酸)で8と12 h.ヒアルロン酸の最終製品は、8のmrを有します×104,追加された物質は、連鎖球菌zooepidemicusの成長に影響を与えません。添加物を分解することで、発酵過程で添加したヒアルロン酸と同じ量のlm-wヒアルロン酸が得られた。liuら[14]8時間発酵中、発酵スープにヒアルロン酸asを異なる濃度で添加した。質量濃度0.15、0.20、0.25 g・l-1では、ヒアルロン酸のmrはそれぞれ4.5×104、3.2×104、2.1×104に減少した。

微生物発酵は一般的な生産方法であるヒアルロン酸粉また、発酵条件を変えることにより、低分子ヒアルロン酸を直接生産することで、その後の分解プロセスの必要性を排除することができます。さらに発酵条件を最適化すれば、実際のニーズに応じて発酵条件を調整することができ、異なるmrでヒアルロン酸を直接生産することができるため、生産コストを削減することができ、lm-wヒアルロン酸を大量生産するための高い応用価値があります。

低分子ヒアルロン酸粉末の2生物学的活性

研究はそれを示しているヒアルロン酸粉末の生物活性分子量に大きく依存しますこの記事では、低分子ヒアルロン酸の抗腫瘍、炎症促進反応、免疫調節の生物学的活性に焦点を当てます。

2. 1 Anti-tumor効果

alanizら[15]はそれを示している低分子ヒアルロン酸でvivoおよびin vitroにおける大腸がん(crc)細胞の増殖を減少させた。この体外実験の结果、low-dose低分子ヒアルロン酸(20μg・mL-1)唯一運ばれた条件だっの拡散を大幅に減らして腫瘍CT26細胞を選びますこの効果はcd44受容体によって媒介され、低分子ヒアルロン酸(1 ~ 3)×105基を使用した場合、高mrヒアルロン酸(1.5 ~ 1.8)×106基を使用した場合と比較して、ct26細胞のアポトーシスが有意に増加した(約50%)。in vivo実験では、低分子ヒアルロン酸は、大腸がん細胞の増殖を減少させ、腫瘍を持つマウスの生存率を高めることが示されました。著者たちは、この機構が樹状細胞(dc)による抗原提示を増やすことによって抗腫瘍効果を発揮するものだと推測している。藤代はらができます。[16]ヒアルロン酸ているCRC細胞の成長と分化を制限するhyaluronanに関連してアポトーシスを抑えることで機構syntase 3 (hyaluronansyntase 3 hyaluronan S3)。低分子の作用機構ヒアルロン酸anti-tumorはまだらちがあかない、と関連するれるを出すボクシングからの集中力との反応をその他マトリクス部品ぞmicroenvironment贩売。

2.2炎症反応の促進

この関係については多くの研究結果がある低分子ヒアルロン酸と炎症。早くも1996年には、mckeeら[17]は、低分子ヒアルロン酸がマクロファージに単核細胞を発現させることができることを発見しました protein-1α(MIP-1α)、macropヒアルロンacidge - flammatory protein-1β(MIP-1β)ケモカインなどの、炎症も生じた。Voel MIP-1α)、炎症れるマクロファージ・コロニータンパク質1β(れるマクロファージ・コロニー炎症protein-1β、MIP-1β)、炎症など起こしかねない。voelckerら[18]は、ヒアルロン酸断片がtoll様受容体(tlr)と考えられ、炎症反応を引き起こすと考えている。

farwickら[19]は、再構築されたヒトの表皮モデルを用い、それを発見した2×104ヒアルロン酸表情を大幅にupregulate肿疡の壊死因子(TNF -α))このモデルで炎症反応を示す。が、5×104ヒアルロン酸は呆れた表情を大きく変えるないなかったTNF -αことは沢山の反応を示す。lyleら[20]は、マウス細胞raw264の一酸化窒素産生に対するヒアルロン酸のmrの違いによる影響を調べた。7炎症性または非炎症性の条件下で(一酸化窒素は、マクロファージを介した炎症反応の直接的な指標である)。このことは、エンドトキシンが極端に低いレベルまで低下しても、低分子ヒアルロン酸は正常な組織で直接マクロファージを介した炎症反応を誘導しないことを示している。

2.3免疫規制

国内外の研究で確認されているヒアルロン酸が関与していますヒトの免疫システムの制御に影響を与えています低濃度のヒアルロン酸は、食細胞とナチュラルキラー細胞にわずかな刺激効果をもたらしますが、リンパ球の変化と赤血球のロゼットの形成を阻害します。同時に、高濃度のヒアルロン酸は、リンパ球、食細胞、ナチュラルキラー細胞などに対して顕著な阻害効果を示します[21]。alanizら[22]は、低分子ヒアルロン酸が特異的な細胞傷害性tリンパ球応答と免疫保護応答を産生する一方で、dcの成熟を促進し、il-12の産生を増加させ、il-10の産生を減少させることを発見した。低分子ヒアルロン酸で前処理された樹状細胞/ tリンパ球(dc / tl)はケモカインリガンド19 (ccl-19)およびケモカインリガンド21 (ccl-21)への移動能を改善し、これらの移動能はリンパ節におけるdc / tl細胞の凝集を促進する。

2. 4名

低分子ヒアルロン酸他にも様々な生物活動がありますpilloniらは、in vitro実験で、低分子ヒアルロン酸が間葉系細胞の移動と分化を促進し、それによって骨形成を促進することを示した。Gariboldiら。[24]肌ダメージの場合は至るところに见られ、低分子ヒアルロン酸を刺激みずみずしい素肌の生産を増やすβ-defensin 2ており、肌治癒機能を高めている。これは、β-デフェンシンの産生の増加によって引き起こされる皮膚の増加した抗菌活性によるものであってもよいです2。

3展望

準備低分子ヒアルロン酸パウダー研究と応用の前提条件です現在、大規模な生産に使用される方法は、主に化学分解法であり、得られた製品の構造に大きな影響を与える。これに対し、生分解法は、反応条件が穏やかでプロセスも簡単で、最適な低分子ヒアルロン酸構造を生成する分解法です。一方、微生物発酵法によるlm-wヒアルロン酸の製造は、産業的に発展する価値のある新しい方法ですが、この方法はまだ大規模生産には程遠いです。したがって、それぞれの手法については、さらなる検討と研究が必要である。

低分子ヒアルロン酸パウダー多様な生物活性を有しており、それに基づいて生物剤の開発・調製が可能である。例えば、抗腫瘍効果は腫瘍治療のアジュバントとして開発されることが期待されます。さらに、その免疫調節効果は免疫アジュバントの準備にも役割を果たすことができます。低分子ヒアルロン酸には他にも多くの生物学的活性がありますが、体系的な薬理学的研究や臨床試験はまだ行われていません。これらはいずれも低分子ヒアルロン酸の未解決の問題であり、より深い研究が必要です。

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