アスタキサンチンの製造方法は何ですか?

アスタキサンチンは、経済的かつ実用的価値の高いカロテノイドである。その多様な生理機能から注目されています。アスタキサンチンはビタミンeよりも強い抗酸化活性を持っていますβ-carotene[1]、細胞の酸化的損傷およびがん性変化を効果的に阻害することができる[2]。また、抗高血圧、心血管疾患の予防、免疫力強化、紫外線からの保護など、多くの効果があります。さらに、アスタキサンチンは、その抗酸化作用およびその他の生理学的および生化学的活性のために食品添加物としても使用することができます[3]。そのため、医療、食品、飼料、健康製品、化粧品の分野でのアスタキサンチンの適用は日々増加しています。

この記事では構造的な性質について説明しますアスタキサンチンの原料と製造方法phafia rhodozymaによって生産されるアスタキサンチンの生合成経路、発酵培養条件、分解細胞からのアスタキサンチンの抽出・精製方法に着目し、アスタキサンチン工業生産の理論的基盤を提供した。

1 .アスタキサンチンの性質と構造

アスタキサンチン(astaxanthin)は、3,3&の化学名を持つ不飽和テルペンである#39; -dihydroxy -β、β' -carotene-4、4'-ジオンと分子式c40h52o4[4]。融点は216°c、沸点は774°c、100 kpaである[5]。アスタキサンチンは疎水性で、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に室温で容易に溶解し[6]、メタノール、エタノール、石油エーテルなどの極性の高い有機溶媒にはわずかに溶解します。アスタキサンチンは光、酸素、温度などに敏感で、分解反応を起こしやすく、生物活性を失う。

天然のアスタキサンチンは長い炭素鎖からなる共役4ブチルゴムを構造および2倍債券とsix-memberedリングとα-hydroxy両端ketone団体があるに似た分子构造β-carotene。6員環上の2つのヒドロキシ基がキラル中心を形成し、これがアスタキサンチンを3つの異なる形で形成する:レボロタリー(3 s-3&)#39; S)、dextrorotary (3R-3' r)とラセミ(3 r-3' S)。

ヘマトコッカス・プルビアリス(haematococcus pluvialis)は1.5%から3.0% (3 s-3' S)アスタキサンチン乾燥重量、主にアスタキサンチン二エステルおよびアスタキサンチンモノエステルの形で[7]。1972年、phaff h j[8]は、赤色のphaff酵母がアスタキサンチンを合成し、dextrorotatory (3 r-3&)を生成することを発見した#39; R)アスタキサンチンます。現在のところ、赤色のphaff酵母のみが天然のアスタキサンチン(3 r-3&)を生産することが知られている#39; r)の構成、およびこの自然な構成アスタキサンチンは生物学的利用能が高い人体では[9]。

2アスタキサンチンの天然資源と製造方法

源2.1ささやきかける

アスタキサンチンは動物(水生動物や鳥類など)、植物、菌類、藻類、細菌に広く見られる。野生のサケは食物連鎖からアスタキサンチンを摂取するが、養殖サケは食物連鎖からアスタキサンチンを摂取することで肉の色が変化する[10]。フラミンゴの羽の鮮やかな色もアスタキサンチンの存在によるものです。内容と動物におけるアスタキサンチンの状態は様々である。例えば、鮭の筋肉、内臓、血漿中のアスタキサンチンは主に遊離状態にあり、皮膚、鱗、卵中のアスタキサンチンは主にエステル化状態にある。おれ達はセルフに騙されたアスタキサンチンを一から合成するそして、それは藻類、酵母、および植物から得られる必要がある[11]。現在、アスタキサンチンは広く使用されており、消費者の需要は絶えず増加しています。依存食品に含まれるアスタキサンチンチェーンは、さまざまな産業のニーズを満たすためには不十分です。既存のアスタキサンチンの製造方法は、主に化学合成、天然抽出、生合成である。

2.2製法

2.2.1化学合成

化学合成法を参照してください多段階化学反応および生物触媒反応を用いたアスタキサンチンの製造。化学合成法は、合成方法の違いにより、半合成法と全合成法に分けられる。半合成法は、アスタキサンチン代謝経路の前駆物質(ルテイン、カンタキサンチンなど)を原料としてアスタキサンチンを調製する方法である;全合成法とは、化学合成によってアスタキサンチンを完全に得る方法である[12]。

化学合成されたアスタキサンチンは、製造コストが低いという利点があります高収率、純度96%以上のアスタキサンチン[13]。しかし、化学的に合成されるアスタキサンチンは様々な配座の混合物であり、副生成物を含んでいるため、体内での吸収・利用率は低い[14]。その安定性、安全性、および抗酸化活性は、天然抽出アスタキサンチンよりも低い[15]。

2.2.2自然抽出法

天然のアスタキサンチンは主に海洋生物に見られる。エビやカニなどのアスタキサンチンを豊富に含む加工副産物を粉砕し、石灰を取り除き、有機溶剤を用いてアスタキサンチンを抽出する方法を自然抽出法という。この方法は養殖業の発展を促進すると同時に、水産物の廃棄副産物による環境汚染を減らすことができる。しかし、廃棄されるエビやカニの殻は灰分やキチン含有量が高く、アスタキサンチン含有量が少ないため抽出工程が複雑であり、抽出コストが高いという課題がある[16]。

2.2.3微生物発酵法

酵母、藻類、細菌を使用する方法アスタキサンチンの製造は微生物発酵法と呼ばれています。主な株には、1細胞の緑藻類であるhaematococcus pluvialis、chlorella aeruginosa[11]、rhodotorula rubra、rhodotorula glutinosa[18]、paracoccus[19-20]がある。発酵ベースのアスタキサンチン製造は、構造が明確で副産物が少なく、環境に優しい製品です。しかし、低収率、厳しい培養条件、高い培養コストなどの制約を受けている。微生物発酵によるアスタキサンチン生産においては、安価な培養材料を用い、高品質・高収量の株を選択・育種して工業生産を行うことが重要です。

3 Astaxanthin-producing微生物

3.1アスタキサンチンを産生する藻類

多くの藻類は、haematococcus pluvialis、クラミドモナス、acetabularia、euglenaなどのアスタキサンチンを生成することができます。ヘマトコッカス・プルビアリス(haematococcus pluvialis)は、葉緑藻綱に属する淡水単細胞の緑藻類である。ヘマトコッカス属(haematococcus属)は、主にアスタキサンチンを産生する藻類である。haematococcus pluvialis細胞のアスタキサンチンは、主にジエステル化アスタキサンチンとモノエステル化アスタキサンチンとして存在し、少量は遊離状態にある。しかし、haematococcus pluvialisは成長時間が長く、培養条件が厳しく、光を必要とし、生産場所が限られており、厚肉胞子の中にアスタキサンチンが含まれており、抽出速度が低く、連続性が低い[21-23]。2010年、保健省は新たな食品源としてhaematococcus pluvialisを承認した。それ以来、国家食品薬品監督管理局の許可を得て、血液球菌プルビアリスアスタキサンチンが豊富な各種健康食品。これらの措置は、アスタキサンチン製品の研究開発を促進し、業界の急速な発展に肯定的な影響を与えている[24]。

クロレラpyrenoidosaは、緑藻の別のことです生産自然アスタキサンチン。クロレラ・ピレノイドサのアスタキサンチン含有量は、haematococcus pluvialisよりも低いが、この藻類は栽培に特別な利点を持っている。クロレラ・ピレノイドサ(chlorella pyrenoidosa)は、グルコースを唯一の炭素源とする好気性の従属栄養生物である。成長が早く、超高細胞密度に達することができ、不利な環境条件に敏感でなく、屋内外での栽培が容易です。

3.2 .アスタキサンチンを産生する細菌

アスタキサンチンは、brevibacterium、corynebacterium、mycobacterium lacticolaなどの様々な細菌に含まれている。ほとんどの細菌のアスタキサンチン含有量は藻類やロドトルラglutinisに比べてはるかに低い[25-27]が、合成関連遺伝子を細菌に導入することで、低アスタキサンチン産生の問題を改善することができる。特にグラム陰性菌[28]は細胞壁が薄く壊れやすいため、色素を抽出しやすく、大規模高密度発酵培養に適している[11]。細菌発酵によるアスタキサンチンの生産は、天然アスタキサンチンの生産コストを大幅に削減することができ、今後のアスタキサンチン工業生産に大きな意義を持つ。

3.3酵母によるアスタキサンチンの生産

酵母発酵によるアスタキサンチン生産に使用される主な株には、rhodotorula glutinis、rhodotorula rubra[29]、rhodotorula benthica[30-31]、rhodotrula glutinisがある。

レッドファイフ酵母は、真菌界、真菌門、不完全な真菌の亜門、クリプトコッカス属、レッドファイフ酵母属の唯一の種です。無性生殖では出芽して再生産し、有酸素呼吸と無酸素呼吸の両方で代謝する。現在、国内外でアスタキサンチンを生産するために微生物発酵のために一般的に使用される真菌である[32-34]。rhodotorula favaの野生株のアスタキサンチン含有量は乾燥細胞質量の0.05%であり、一部の変異株は1.0%に達し、全カロテノイド含有量の約80%を占める。赤酵母発酵は、アスタキサンチンを生産する上で、次のような利点があります。さまざまな炭素と窒素源を利用してアスタキサンチンを生産することができ、細胞の成長と増殖が速く、高密度栽培を可能にします。生産サイクルが短く、コストが低い。細胞壁は容易に破壊され、生成されるアスタキサンチンは、dextrorotatory配置にある(3 r-3&#体に吸収されやすい自由な状態にあります。抽出後、酵母細胞体を飼料添加物として直接使用することができます[4,35]。

4酵母によるアスタキサンチンの生合成

多くの研究でmevalonate (MVA)、isopentenyl酸(IPP) farnesyl酸(FPP) dimethylallylpy-rophosphate、geranyl-geranyl酸(GGPP) octahydro-lycopene、tetrahydro-lycopene、β-carotene、などがアスタキサンチンの生経路の重要なintermediatesである。アスタキサンチンのbiosynthetic経路酵母は大きく分けて二段階:第1段階では合成β-carotene;バイオ燃料の生産アスタキサンチン第2段階はβ-carotene酸化とhydroxylationを通じて[36]。

酵母のカロテノイドは、グルコースから始まる解糖系(embden-meyerhof)を通るメチオニン経路に由来する 経路、emp)からピルビン酸が生成され、酸化されて脱炭酸されてアセチル補酵素a(アセチルcoa)が得られ、3分子のアセチルcoaが凝縮してmvaを形成し、リン酸化と脱炭酸によってイソペンテニル二リン酸(c5)に変換される。ippはすべてのイソペンテニル化合物(アスタキサンチン、カロチン、エルゴステロールなど)の合成前駆体である。ippは濃縮されてggpp (c20)を形成し、2分子のggppが二量体化されて無色のオクタヒドロ-トマト赤色色素を形成する。次に多いのが1見せ」とワンステップcyclization合成β-carotene(37)。最後に、アスタキサンチン原料はβだったからで-carotene仕込み二段酵素反応を通じてでketolaseの同時に導入の団体の4位置で水酸化酵素同時に両ヒドロキシ団体の導入をはじめ3βの位置-carotene分子です

5酵母発酵プロセスの制御と最適化

のastaxanthin-producing酵母代謝能力が高く、単糖[38]、二糖および多糖類、有機酸およびアルコールを利用することができます。アンモニア、硝酸塩、尿素、アミノ酸などの単純な窒素源や、酵母エキス、牛肉エキス、麦芽エキス、ペプトンなどの複雑な混合物も迅速に利用できます。また、砂糖製造プロセス、湿式トウモロコシ粉砕プロセス[39]または木材の酵素加水分解溶液[40]からの廃棄物などの生産コストを効果的に削減することができる産業廃棄物を利用することができます。stoklosa r jら[41]は、ピヒア・パストリスを添加した2 l発酵機にスイートソルガムバガス(ssb)を添加して、65.4 mg/ lのアスタキサンチンを生産した。しかし、低コストの培地には、カロチン産生の未知の阻害剤が含まれている可能性があり、製造プロセスには適していない[42]。

ssb加水分解物存在下でのアスタキサンチンの発酵では、ssb中のフェノール化合物の阻害効果によるものと考えられ、代わりに53.3 mg/ lまでアスタキサンチン含有量が減少した[27,41]。ほとんどの場合、培地には必要な栄養素が補充されなければならず、カロチン産生の誘導体や前駆体も含まれている場合があります[43]。新鮮なトマトジュース[44]とニンジンジュース[45]のようないくつかの成分を添加すると、アスタキサンチンの生成を増加させることができます。

栄養素(炭素源、窒素源、金属イオン、ビタミンなど)と物理的要因(温度、ph、酸素供給など)は、細胞の成長とアスタキサンチンの生産に影響を与える可能性があります。異なるセルで使用される文献株や高収益の変異を注意深くアスタキサンチンによって実現した異なる構図培地や発酵過程条件(表1参照)。同时に、変異株は遺伝子の破片が挿入されたランダム・,数量や位置正確で機能自然挿入遺伝子は今のところまだ不明大抵の場合、文学間でのcomparabilityに影響を及ぼす可能性もある。栄養素や培養法が細胞増殖やアスタキサンチン産生に与える影響は、以下のようにまとめられます。

赤色酵母は、0 - 27°cの成長温度範囲を持つ中親和性酵母である。使用する(変異株)株にもよりますが、アスタキサンチンの生産と酵母細胞の成長に最適な温度は通常18 ~ 22°cです。アスタキサンチンの合成と酵母の細胞増殖に最適なphは通常5 ~ 6である。酵母の細胞増殖に最適な温度またはphは、一般的にアスタキサンチンの合成および蓄積に最適な温度またはphとは異なります。そのため、発酵中にphや温度を変化させると、発酵中のアスタキサンチン生産量が増加します。変異株でも野生株でも、培地の温度やphは細胞のアスタキサンチン含有量やカロテノイド組成に強い影響を及ぼす[52-53]。

アスタキサンチン生合成では酸素が重要な役割を果たしており、蓄積量は酸素移動速度に関係している。酸素不足でβの蓄積を招く-caroteneβの効率を減らして-carotene酸化アスタキサンチン。したがって、十分な酸素はアスタキサンチンの蓄積を助けることができる[54]。空気飽和度10% ~ 20%の臨界溶存酸素濃度があり、それ以下の溶存酸素濃度は細胞の成長とカロテノイドの形成を阻害する。

しかし、過剰な酸素含有量は酵母細胞の成長を阻害する。そのため、赤血球に適切な量の酸素を供給することで、アスタキサンチン合成を改善することができます。そのため、異なる菌株を培養する際には、発酵装置の速度を調整するために菌の酸素消費量を測定する必要がある。調整に加えてスピードを変える空を流量中酸素濃度を増やすに利き酸素性の高い有機溶剤溶存量を加えとして文化媒体に酸素キャリアオレイン酸などn-dodecane、大豆油Tween-80、酢酸エチル、も改善できる細胞の酸素乗り換え率破壊するのに十分です

彼の急速な成長フェイズ糖分の濃度・リコピン総合2処理を抑えるβ-caroteneとβ-carotene総合アスタキサンチン。したがって、高い炭素源濃度を使用すべきではありません[54]。しかし、細胞成長の後期には、炭素源濃度が高くなるとカロテノイドの蓄積が促進されます[55]。そのため、高バイオマス濃度、高細胞内アスタキサンチン濃度を達成しながら、バッチ供給プロセスを用いることで高糖濃度の拮抗作用を除去することができます。

ロドトルラの発酵過程は、細胞の成長段階と成熟段階の2つの段階に分けられる。低いc / n比(炭素源と窒素源の濃度の比)を提供することにより、細胞は最初は急速に成長し、高い細胞濃度に近づくにつれて成長速度が徐々に遅くなります。この段階では、細胞の成長速度はアスタキサンチンの形成速度よりも高い。細胞が安定成長期に近づくと、高い炭素-窒素比への変換が切り替わり、アスタキサンチンの合成速度が細胞の成長速度よりも高くなります。同一発酵時間内に、異なる発酵段階での炭素源濃度と炭素-窒素比を調整することで、高い細胞収率と高いアスタキサンチン収率を同時に達成することができます。

使用される(変異体)系統と培地は、最大のプロセス生産性を達成するために供給制御を決定し、いくつかの方法で確立することができます。例えば、monod指標に基づく給餌、ph-stat制御[40]、do-stat培養制御、炭素源濃度を決定した後のパルス給餌(表1参照)などである。表1のデータを評価すると、パルス給餌とfed-batch給餌の方が良いと思われる。成熟期にアスタキサンチンを増加させる別の方法は、最初の代謝性炭素源が枯渇した後に、グリセロールや酢酸のようなゆっくりと代謝された炭素源を加えることである。

異なるソースからのアスタキサンチンのための6精製法

6.1アスタキサンチンの細胞壁を破壊する方法

アスタキサンチンは細胞内生成物であり、一般的に酵母細胞から抽出する前に細胞壁の破壊、抽出、精製などの工程を経なければなりません。一般的に使用される細胞壁破壊方法には、機械的方法、化学的方法[56]、酵素法および熱処理[57]があります。

機械的方法は、機械装置を使用して細胞壁を破り、細胞内の浸透圧によって内容物を解放します。主な方法は、超音波破砕、ビーズ粉砕、スプレー衝撃破砕、高圧均質化です。機械的方法は操作が容易であるため広く用いられていますが、場所によっては溶液温度が上昇しやすく、アスタキサンチンが失われてしまいます。

化学的方法には、主にジメチルスルホキシド法、酸塩基加熱法、有機溶剤透過法があります。アルカリ抽出法や酸加水分解法では、壁を壊すために大量のアルカリと有機酸を消費し、汚水の排出量を増やし、環境汚染を引き起こしています。さらに、強酸と塩基はアスタキサンチンを損傷する可能性があります。5.55 mol/ lの乳酸濃度と30℃の破砕温度により、アスタキサンチンの損傷を減らすことができる。抽出された最終総カロテノイド内容アスタキサンチンと1億2947μg / g, 1 516.0μg / g、それぞれアスタキサンチンの合计は全体は85.4パーセントであっエキス(56)。

β-glucanaseと胃のカタツムリ酵素はhydrolyze細胞壁の骨格成分β-glucan、よりも効率的に細胞壁の輪を断ち切るより他の方法およびアスタキサンチンのロスを避けるため細胞から漏れの断片です酵素処理は、条件が穏やかで、装置の必要性が低く、処理プロセスによる環境汚染が少ない。抽出されたアスタキサンチンは、他の方法で得られたものよりも安定である。

現在、パルス電場(pef)[58]、高圧マイクロ流体化(hpmf)、イオン液体(イオン液体、ils)[59]などの活性成分を抽出するために、現代の抽出方法の様々な開発されていると、他の新興技術。pefの適用は、細胞に致命的な損傷を引き起こしたり、細胞膜の一時的な透過や細胞室間の帯電物質の電気泳動を介して亜致死的なストレスを引き起こす可能性があります。いくつかの研究者は、微細藻類から異なる価値のある化合物を抽出するためにpefを使用することを研究している。

hpmfは、エマルジョン中の高速衝撃、強力なせん断、過渡的な圧力降下、高周波振動、キャビテーション、および超高圧(最大200 mpa)、高分子修飾および生物活性成分の抽出のための新しい技術です。従来の高圧ホモジナイザーと比較して、バルブやチャンバの設計が異なり、使用圧力が高くなっています。ilsは、緩く一緒に保持され、無視できる蒸気圧、低い溶融温度、優れた熱的および化学的安定性によって特徴付けられる陽イオンと陰イオンから構成されています。

また、セルロースの溶解性が高く、イオン液体の混合物はクロレラの脂質抽出に影響を与えません。したがって、ilsはクロレラから脂質やタンパク質を回収するために使用できる新しい細胞破壊技術である。haematococcus pluvialisからのアスタキサンチン抽出に対する細胞壁破壊の効率を、pef、超音波(us)、hpmf、hclおよびilsなどのさまざまな技術を用いて比較した。その結果、細胞壁破壊にはils、hcl、hpmfが最も効果的であり、アスタキサンチン抽出率は80%以上であったが、pefおよびusは細胞壁破壊にはあまり効果がなかった[60]。従来の細胞破壊技術と比較して、pef、hpmf、ilsなどの新しい細胞破壊技術はアスタキサンチンへの影響が少ない。また、溶剤の使用量が少なく、時間の節約、省エネ、環境に優しいです。

6.2アスタキサンチン抽出法

アスタキサンチンは脂溶性物質で、有機溶媒には溶けますが、水には溶けません。アセトン、エタノール、メタノール、石油エーテルなどの極性有機溶媒を用いて抽出することができる。ナンキョクオキアミからの全カロテノイドの抽出率に異なる溶媒の影響を与えた結果、無水エタノールが最も抽出効果が高く、総カロテノイドの抽出率は73.3%であった[61]。しかし、アスタキサンチンは有機溶媒には溶けますが、溶解度が低いため、1回の溶媒抽出では効果が限られます。huang kaichenら[62]は、抽出溶液として酢酸エチルとエタノールの2:1の混合物を用いたが、酸加熱によって抽出されたアスタキサンチン含有量は単一溶液よりも有意に高かった。

6.3アスタキサンチンの精製と検出方法

アスタキサンチンの精製には、薄い層クロマトグラフィー(tlc)とカラムクロマトグラフィーが主に使用されます。薄い層クロマトグラフィーを使用すると、粗抽出物の組成を簡単に決定できます。しかし、この方法は分解能が低く再現性が低く、外部要因の影響を受けやすく、作業者の要求が高く、精製後の実験作業には向いていませんでした。カラムクロマトグラフィーは、他の精製法と比較して安価かつ簡便であり、定常相や移動相の代替が可能であることから、最も一般的に使用されています。異なる固定相と移動相を組み合わせることで、比較的単純なサンプルの分離と精製を実現でき、幅広い用途に使用できます。

薄膜クロマトグラフィーとカラムクロマトグラフィーは、初期精製に適しています。その後、高性能液体クロマトグラフィー(hplc)を使用して精製することができ、98%以上の精製効果を得ることができますが、準備コストが高くなります。hplcは高純度のアスタキサンチンを得ることができるだけでなく、適切な移動相とc18またはc30の高性能液体クロマトグラフィー用カラムを使用して、アスタキサンチン含有量を正確に決定することができます。実験では、生成されるアスタキサンチンの量を迅速に決定するために、uv-vis分光測光法が用いられることが多い。

7まとめと展望

アスタキサンチンは、医薬品、化粧品、健康食品、飼料添加物などの分野で開発可能性が高く、高い価値があり、開発の余地がある。天然のアスタキサンチンと化学的に合成されたアスタキサンチンの調製過程にはいくつかの欠点がある。今後のアスタキサンチンの微生物合成研究では、安定した遺伝形質を持つ高収量株の開発、低コストの培養材料の使用、簡単な生産プロセスの探索、高度で迅速かつ正確な抽出・精製技術を用いたアスタキサンチンの生産コストの低減、収率と純度の向上を目指します。

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