アスタキサンチンの製造方法は何ですか?

アスタキサンチン is a カロテノイドwith high economic とpractical value. It has attracted much attention due to its various physiological functions. Astaxanthin has stronger antioxidant activity than vitamin E とβ-carotene [1], とcan effectively inhibit oxidative damage とcancerous changes in cells [2]. It also has many other effects, such as anti-hypertension, prevention of cardiovascular disease, immune enhancement, and protection against ultraviolet radiation. In addition, アスタキサンチンcan also be used as a food additive due to its antioxidant properties and other physiological and biochemical activities [3]. Therefore, the application of astaxanthin in the fields of medicine, food, feed, health products and cosmetics is increasing day by day.

本稿では、phafia rhodozymaによって生産されるアスタキサンチンの生合成経路、発酵培養条件、壊れた細胞からのアスタキサンチンの抽出・精製方法に焦点を当て、アスタキサンチンの構造特性、原料および製造方法について説明し、アスタキサンチン工業生産の理論的基礎を提供する。

1 .アスタキサンチンの性質と構造

アスタキサンチン(astaxanthin)は、3,3&の化学名を持つ不飽和テルペンである#39; -dihydroxy -β、β' -carotene-4、4'-ジオンと分子式c40h52o4[4]。融点は216°c、沸点は774°c、100 kpaである[5]。アスタキサンチンは疎水性で、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に室温で容易に溶解し[6]、メタノール、エタノール、石油エーテルなどの極性の高い有機溶媒にはわずかに溶解します。アスタキサンチンは光、酸素、温度などに敏感で、分解反応を起こしやすく、生物活性を失う。

自然アスタキサンチン consists of a long carbon chain with four isoprene structures and a conjugated double bond, and a six-membered ring with α-hydroxy ketone groups at both ends. The molecular structure is similar to that of β-carotene. The two hydroxyl groups on the six-membered on the hexamer form the chiral center, which forms astaxanthin in three different configurations: levorotary (3S-3' S)、dextrorotary (3R-3' r)とラセミ(3 r-3' S)。

ヘマトコッカス・プルビアリス(haematococcus pluvialis)は1.5%から3.0% (3 s-3' s)乾燥重量によるアスタキサンチン、主にアスタキサンチン二エステルおよびアスタキサンチンモノエステルの形で[7]。1972年、phaff h j[8]は、赤色のphaff酵母がアスタキサンチンを合成し、dextrorotatory (3 r-3&)を生成することを発見した#39; R)アスタキサンチンます。現在のところ、赤色のphaff酵母のみが天然のアスタキサンチン(3 r-3&)を生産することが知られている#39; r)の構成と、このアスタキサンチンの自然な構成は、ヒトの体内でより高い生物学的利用能を持っています[9]。

2アスタキサンチンの天然資源と製造方法

源2.1ささやきかける

Astaxanthin is widely found in animals (such as aquatic animals and birds), plants, fungi, algae and bacteria. Wild salmon obtain astaxanthin からthe food chain, but farmed salmon obtain the characteristic colour of their flesh from astaxanthin-containing feed [10]. The brilliant color of flamingo feathers is also due to the presence of astaxanthin. The content and state of astaxanthin in animals vary. For example, the astaxanthin in the muscles, internal organs and plasma of salmon is mainly in the free state, while the astaxanthin in the skin, scales and roe is mainly in the esterified form. No animal can synthesize astaxanthin from scratch, and it needs to be obtained from algae, yeast, and plants [11]. At present, astaxanthin is widely used, and consumer demand is constantly increasing. Relying solely on astaxanthin present in the food chain is insufficient to meet the needs of various industries. Existing astaxanthin 生産methods mainly include chemical synthesis, natural extraction, and biosynthesis.

2.2製法

2.2.1化学合成

The chemical synthesis method refers to the production of astaxanthin using multi-step chemical and biocatalytic reactions. According to the differences in the synthesis method, the chemical synthesis method is divided into the semi-synthesis method and the total synthesis method. The semi-synthesis method refers to the method of preparing astaxanthin using precursor substances (such as ルテイン and canthaxanthin) in the astaxanthin metabolic pathway as raw materials; the total synthesis method refers to the method of obtaining astaxanthin completely using chemical synthesis [12].

化学合成されたアスタキサンチンは、低コスト、高収率、純度96%を超えるという利点があります[13]。しかし、化学的に合成されるアスタキサンチンは様々な配座の混合物であり、副生成物を含んでいるため、体内での吸収・利用率は低い[14]。その安定性、安全性、および抗酸化活性は、天然抽出アスタキサンチンよりも低い[15]。

2.2.2自然抽出法

天然のアスタキサンチンは主に海洋生物に見られる。エビやカニなどのアスタキサンチンを豊富に含む加工副産物を粉砕し、石灰を取り除き、有機溶剤を用いてアスタキサンチンを抽出する方法を自然抽出法という。この方法は養殖業の発展を促進すると同時に、水産物の廃棄副産物による環境汚染を減らすことができる。しかし、廃棄されるエビやカニの殻は灰分やキチン含有量が高く、アスタキサンチン含有量が少ないため抽出工程が複雑であり、抽出コストが高いという課題がある[16]。

2.2.3微生物発酵法

酵母、藻類、細菌を用いてアスタキサンチンを製造する方法は微生物発酵法と呼ばれています。主な株には、1細胞の緑藻類であるhaematococcus pluvialis、chlorella aeruginosa[11]、rhodotorula rubra、rhodotorula glutinosa[18]、paracoccus[19-20]がある。発酵ベースのアスタキサンチン製造は、構造が明確で副産物が少なく、環境に優しい製品です。しかし、低収率、厳しい培養条件、高い培養コストなどの制約を受けている。微生物発酵によるアスタキサンチン生産においては、安価な培養材料を用い、高品質・高収量の株を選択・育種して工業生産を行うことが重要です。

3 Astaxanthin-producing微生物

3.1アスタキサンチンを産生する藻類

Many algae can produce astaxanthin, such as Haematococcus pluvialis, Chlamydomonas, Acetabularia, Euglena, etc. Haematococcus pluvialis is a freshwater single-cell green alga belonging to the Chlorophyta, Chlorophyceae, Haematococcus genus, and is the main astaxanthin-producing algae. The astaxanthin in Haematococcus pluvialis cells mainly exists as diesterified astaxanthin and monoesterified astaxanthin, with a small amount in the free state. However, Haematococcus pluvialis has a long growth time, strict culture conditions, requires light, has limited production sites, and astaxanthin is found in the thick-walled spores, which have a low extraction rate and poor continuity [21-23]. In 2010, the Ministry of Health approved Haematococcus pluvialis as a new source of food. Since then, a variety of health foods rich in Haematococcus pluvialis astaxanthin have been approved by the State Food and Drug Administration. These measures have had a positive impact on promoting the research and development of astaxanthin products and the rapid development of the industry [24].

クロレラ・ピレノイドサ(chlorella pyrenoidosa)は、天然のアスタキサンチンを生産する緑藻である。クロレラ・ピレノイドサのアスタキサンチン含有量は、haematococcus pluvialisよりも低いが、この藻類は栽培に特別な利点を持っている。クロレラ・ピレノイドサ(chlorella pyrenoidosa)は、グルコースを唯一の炭素源とする好気性の従属栄養生物である。成長が早く、超高細胞密度に達することができ、不利な環境条件に敏感でなく、屋内外での栽培が容易です。

3.2 .アスタキサンチンを産生する細菌

アスタキサンチンは、brevibacterium、corynebacterium、mycobacterium lacticolaなどの様々な細菌に含まれている。ほとんどの細菌のアスタキサンチン含有量は藻類やロドトルラglutinisに比べてはるかに低い[25-27]が、合成関連遺伝子を細菌に導入することで、低アスタキサンチン産生の問題を改善することができる。特にグラム陰性菌[28]は細胞壁が薄く壊れやすいため、色素を抽出しやすく、大規模高密度発酵培養に適している[11]。細菌発酵によるアスタキサンチンの生産は、天然アスタキサンチンの生産コストを大幅に削減することができ、今後のアスタキサンチン工業生産に大きな意義を持つ。

3.3酵母によるアスタキサンチンの生産

酵母発酵によるアスタキサンチン生産に使用される主な株には、rhodotorula glutinis、rhodotorula rubra[29]、rhodotorula benthica[30-31]、rhodotrula glutinisがある。

レッドファイフ酵母は、真菌界、真菌門、不完全な真菌の亜門、クリプトコッカス属、レッドファイフ酵母属の唯一の種です。無性生殖では出芽して再生産し、有酸素呼吸と無酸素呼吸の両方で代謝する。現在、国内外でアスタキサンチンを生産するために微生物発酵のために一般的に使用される真菌である[32-34]。rhodotorula favaの野生株のアスタキサンチン含有量は乾燥細胞質量の0.05%であり、一部の変異株は1.0%に達し、全カロテノイド含有量の約80%を占める。赤酵母発酵は、アスタキサンチンを生産する上で、次のような利点があります。さまざまな炭素と窒素源を利用してアスタキサンチンを生産することができ、細胞の成長と増殖が速く、高密度栽培を可能にします。生産サイクルが短く、コストが低い。細胞壁は容易に破壊され、生成されるアスタキサンチンは、dextrorotatory配置にある(3 r-3'R) and is in a free state, which is easily absorbed by the human body. After extraction, the yeast cell body can be directly used as a feed additive [4, 35].

4酵母によるアスタキサンチンの生合成

多くの研究でmevalonate (MVA)、isopentenyl酸(IPP) farnesyl酸(FPP) dimethylallylpy-rophosphate、geranyl-geranyl酸(GGPP) octahydro-リコピン、tetrahydro-lycopene、β-carotene、などがアスタキサンチンの生経路の重要なintermediatesである。アスタキサンチンのbiosynthetic経路酵母は大きく分けて二段階:第1段階では合成β-carotene;バイオ燃料の生産アスタキサンチン第2段階はβ-carotene酸化とhydroxylationを通じて[36]。

酵母のカロテノイドは、グルコースから始まる解糖系(embden-meyerhof)を通るメチオニン経路に由来する pathway, EMP) to produce pyruvate, and then oxidized and decarboxylated to obtain acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA), and three three molecules of Acetyl-CoA condense to form MVA, which is then converted by phosphorylation and decarboxylation into isopentenyl pyrophosphate (C5). IPP is the synthetic precursor of all isopentenyl compounds (such as astaxanthin, carotene and ergosterol). IPP is condensed to form GGPP (C20), and two molecules of GGPP undergo dimerization to form the colorless octahydro-tomato red pigment, which is considered to be the first specific step in carotenoid synthesis. This is followed by a multi-step dehydrogenation and a one-step cyclization to synthesize β-carotene [37]. Finally, astaxanthin is produced from β-carotene through a two-step enzymatic reaction, in which ketolase catalyzes the introduction of two ketone groups at the 4 position and hydroxylase catalyzes the introduction of two hydroxyl groups at the 3 position of the β-carotene molecule.

5酵母発酵プロセスの制御と最適化

アスタキサンチン産生酵母は、高い代謝能力を有し、単糖[38]、二糖および多糖類、有機酸およびアルコールを利用することができる。アンモニア、硝酸塩、尿素、アミノ酸などの単純な窒素源や、酵母エキス、牛肉エキス、麦芽エキス、ペプトンなどの複雑な混合物も迅速に利用できます。また、砂糖製造プロセス、湿式トウモロコシ粉砕プロセス[39]または木材の酵素加水分解溶液[40]からの廃棄物などの生産コストを効果的に削減することができる産業廃棄物を利用することができます。stoklosa r jら[41]は、ピヒア・パストリスを添加した2 l発酵機にスイートソルガムバガス(ssb)を添加して、65.4 mg/ lのアスタキサンチンを生産した。しかし、低コストの培地には、カロチン産生の未知の阻害剤が含まれている可能性があり、製造プロセスには適していない[42]。

ssb加水分解物存在下でのアスタキサンチンの発酵では、ssb中のフェノール化合物の阻害効果によるものと考えられ、代わりに53.3 mg/ lまでアスタキサンチン含有量が減少した[27,41]。ほとんどの場合、培地には必要な栄養素が補充されなければならず、カロチン産生の誘導体や前駆体も含まれている場合があります[43]。新鮮なトマトジュース[44]とニンジンジュース[45]のようないくつかの成分を添加すると、アスタキサンチンの生成を増加させることができます。

栄養素(炭素源、窒素源、金属イオン、ビタミンなど)と物理的要因(温度、ph、酸素供給など)は、細胞の成長とアスタキサンチンの生産に影響を与える可能性があります。異なるセルで使用される文献株や高収益の変異を注意深くアスタキサンチンによって実現した異なる構図培地や発酵過程条件(表1参照)。同时に、変異株は遺伝子の破片が挿入されたランダム・,数量や位置正確で機能自然挿入遺伝子は今のところまだ不明大抵の場合、文学間でのcomparabilityに影響を及ぼす可能性もある。栄養素や培養法が細胞増殖やアスタキサンチン産生に与える影響は、以下のようにまとめられます。

赤色酵母は、0 - 27°cの成長温度範囲を持つ中親和性酵母である。使用する(変異株)株にもよりますが、アスタキサンチンの生産と酵母細胞の成長に最適な温度は通常18 ~ 22°cです。アスタキサンチンの合成と酵母の細胞増殖に最適なphは通常5 ~ 6である。酵母の細胞増殖に最適な温度またはphは、一般的にアスタキサンチンの合成および蓄積に最適な温度またはphとは異なります。そのため、発酵中にphや温度を変化させると、発酵中のアスタキサンチン生産量が増加します。変異株でも野生株でも、培地の温度やphは細胞のアスタキサンチン含有量やカロテノイド組成に強い影響を及ぼす[52-53]。

アスタキサンチン生合成では酸素が重要な役割を果たしており、蓄積量は酸素移動速度に関係している。酸素不足でβの蓄積を招く-caroteneβの効率を減らして-carotene酸化アスタキサンチン。したがって、十分な酸素はアスタキサンチンの蓄積を助けることができる[54]。空気飽和度10% ~ 20%の臨界溶存酸素濃度があり、それ以下の溶存酸素濃度は細胞の成長とカロテノイドの形成を阻害する。

しかし、過剰な酸素含有量は酵母細胞の成長を阻害する。そのため、赤血球に適切な量の酸素を供給することで、アスタキサンチン合成を改善することができます。そのため、異なる菌株を培養する際には、発酵装置の速度を調整するために菌の酸素消費量を測定する必要がある。調整に加えてスピードを変える空を流量中酸素濃度を増やすに利き酸素性の高い有機溶剤溶存量を加えとして文化媒体に酸素キャリアオレイン酸などn-dodecane、大豆油Tween-80、酢酸エチル、も改善できる細胞の酸素乗り換え率破壊するのに十分です

During the exponential growth phase, high sugar concentrations inhibit the two processes of lycopene synthesis β-carotene and β-carotene synthesis astaxanthin. Therefore, high carbon source concentrations should not be used [54]. However, in the later stages of cell growth, high carbon source concentrations can promote the accumulation of carotenoids [55]. Therefore, the antagonistic effect of high sugar concentrations can be eliminated by using a batch feeding process, while achieving high biomass and high intracellular astaxanthin concentrations.

ロドトルラの発酵過程は、細胞の成長段階と成熟段階の2つの段階に分けられる。低いc / n比(炭素源と窒素源の濃度の比)を提供することにより、細胞は最初は急速に成長し、高い細胞濃度に近づくにつれて成長速度が徐々に遅くなります。この段階では、細胞の成長速度はアスタキサンチンの形成速度よりも高い。細胞が安定成長期に近づくと、高い炭素-窒素比への変換が切り替わり、アスタキサンチンの合成速度が細胞の成長速度よりも高くなります。同一発酵時間内に、異なる発酵段階での炭素源濃度と炭素-窒素比を調整することで、高い細胞収率と高いアスタキサンチン収率を同時に達成することができます。

使用される(変異体)系統と培地は、最大のプロセス生産性を達成するために供給制御を決定し、いくつかの方法で確立することができます。例えば、monod指標に基づく給餌、ph-stat制御[40]、do-stat培養制御、炭素源濃度を決定した後のパルス給餌(表1参照)などである。表1のデータを評価すると、パルス給餌とfed-batch給餌の方が良いと思われる。成熟期にアスタキサンチンを増加させる別の方法は、最初の代謝性炭素源が枯渇した後に、グリセロールや酢酸のようなゆっくりと代謝された炭素源を加えることである。

異なるソースからのアスタキサンチンのための6精製法

6.1アスタキサンチンの細胞壁を破壊する方法

アスタキサンチンは細胞内生成物であり、一般的に酵母細胞から抽出する前に細胞壁の破壊、抽出、精製などの工程を経なければなりません。一般的に使用される細胞壁破壊方法には、機械的方法、化学的方法[56]、酵素法および熱処理[57]があります。

機械的方法は、機械装置を使用して細胞壁を破り、細胞内の浸透圧によって内容物を解放します。主な方法は、超音波破砕、ビーズ粉砕、スプレー衝撃破砕、高圧均質化です。機械的方法は操作が容易であるため広く用いられていますが、場所によっては溶液温度が上昇しやすく、アスタキサンチンが失われてしまいます。

化学的方法には、主にジメチルスルホキシド法、酸塩基加熱法、有機溶剤透過法があります。アルカリ抽出法や酸加水分解法では、壁を壊すために大量のアルカリと有機酸を消費し、汚水の排出量を増やし、環境汚染を引き起こしています。さらに、強酸と塩基はアスタキサンチンを損傷する可能性があります。5.55 mol/ lの乳酸濃度と30℃の破砕温度により、アスタキサンチンの損傷を減らすことができる。抽出された最終総カロテノイド内容アスタキサンチンと1億2947μg / g, 1 516.0μg / g、それぞれアスタキサンチンの合计は全体は85.4パーセントであっエキス(56)。

β-glucanase and snail enzymes can hydrolyze the cell wall skeleton component β-glucan, which can break the cell wall more effectively than other methods and avoid the loss of astaxanthin due to leakage from the cell. Enzyme treatment has mild conditions, low equipment requirements, and the treatment process causes less environmental pollution. The extracted astaxanthin is also more stable than that obtained by other methods.

At present, a variety of modern extraction methods have been developed for extracting active ingredients, such as pulsed electric field (PEF) [58], high-pressure microfluidisation (HPMF), ionic 液体(ionic liquids, ILs) [59] and other emerging technologies. The application of PEF may cause lethal damage to cells or induce sublethal stress through transient permeabilization of cell membranes and electrophoretic movement of charged substances between cell compartments. Some scholars have studied the use of PEF to extract different valuable compounds from microalgae.

hpmfは、エマルジョン中の高速衝撃、強力なせん断、過渡的な圧力降下、高周波振動、キャビテーション、および超高圧(最大200 mpa)、高分子修飾および生物活性成分の抽出のための新しい技術です。従来の高圧ホモジナイザーと比較して、バルブやチャンバの設計が異なり、使用圧力が高くなっています。ilsは、緩く一緒に保持され、無視できる蒸気圧、低い溶融温度、優れた熱的および化学的安定性によって特徴付けられる陽イオンと陰イオンから構成されています。

In addition, they have a high capacity for dissolving cellulose, and mixtures イオンliquids have a low effect on the lipid extraction of chlorella. Therefore, ILs are a novel cell disruption technique that can be used to recover lipids and proteins from chlorella. The efficiency of cell wall disruption for the extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis was compared using various techniques such as PEF, ultrasound (US), HPMF, HCl and ILs. The results showed that ILs, HCl and HPMF treatments were the most effective in cell disruption, with an astaxanthin extraction rate of over 80%, while PEF and US were less effective in cell wall disruption [60]. Compared with traditional cell disruption techniques, emerging cell disruption techniques such as PEF, HPMF and ILs have less impact on astaxanthin. They also use less solvent, are time-saving, energy-saving and environmentally-friendly.

6.2アスタキサンチン抽出法

アスタキサンチンは脂溶性物質で、有機溶媒には溶けますが、水には溶けません。アセトン、エタノール、メタノール、石油エーテルなどの極性有機溶媒を用いて抽出することができる。ナンキョクオキアミからの全カロテノイドの抽出率に異なる溶媒の影響を与えた結果、無水エタノールが最も抽出効果が高く、総カロテノイドの抽出率は73.3%であった[61]。しかし、アスタキサンチンは有機溶媒には溶けますが、溶解度が低いため、1回の溶媒抽出では効果が限られます。huang kaichenら[62]は、抽出溶液として酢酸エチルとエタノールの2:1の混合物を用いたが、酸加熱によって抽出されたアスタキサンチン含有量は単一溶液よりも有意に高かった。

6.3アスタキサンチンの精製と検出方法

アスタキサンチンの精製には、薄い層クロマトグラフィー(tlc)とカラムクロマトグラフィーが主に使用されます。薄い層クロマトグラフィーを使用すると、粗抽出物の組成を簡単に決定できます。しかし、この方法は分解能が低く再現性が低く、外部要因の影響を受けやすく、作業者の要求が高く、精製後の実験作業には向いていませんでした。カラムクロマトグラフィーは、他の精製法と比較して安価かつ簡便であり、定常相や移動相の代替が可能であることから、最も一般的に使用されています。異なる固定相と移動相を組み合わせることで、比較的単純なサンプルの分離と精製を実現でき、幅広い用途に使用できます。

薄膜クロマトグラフィーとカラムクロマトグラフィーは、初期精製に適しています。その後、高性能液体クロマトグラフィー(hplc)を使用して精製することができ、98%以上の精製効果を得ることができますが、準備コストが高くなります。hplcは高純度のアスタキサンチンを得ることができるだけでなく、適切な移動相とc18またはc30の高性能液体クロマトグラフィー用カラムを使用して、アスタキサンチン含有量を正確に決定することができます。実験では、生成されるアスタキサンチンの量を迅速に決定するために、uv-vis分光測光法が用いられることが多い。

7まとめと展望

Astaxanthin has broad development potential and is of great value and has room for development in medicine, cosmetics, health products, feed additives, and other fields. Both the natural astaxanthin and the chemically synthesized astaxanthin preparation processes have certain disadvantages. In the future, research on the microbial synthesis of astaxanthin will focus on developing high-yielding strains with stable genetic traits, using low-cost culture materials, exploring simple production processes, and using advanced, rapid and precise extraction and purification techniques to reduce production costs and improve astaxanthin yield and purity.

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