微生物発酵法によるアスタキサンチンの合成に関する研究

アスタキサンチン はのorange-red keto-type カロテノイドとのmolecular formulのC40H52O4 とのchemical name 3,3' -dihydroxy-4、4' -dione-beta、beta' -carotene[2]。アスタキサンチンは、水に不溶で、脂溶性で、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、二硫化炭素などの有機溶媒に可溶で、メタノールやエタノールなどの極性有機溶媒にはわずかに可溶です[3]。アスタキサンチンは、8つのイソプレン単位が共役二重結合で結合したテトラテルペノイドであり、共役二重結合の末端に不飽和ヒドロキシル基とケトン基がある[4]。そのため、アスタキサンチンは以下のような異なる構造を持つ(図1)#39; s)、デextrorotary (3 r、3' r)およびラセミ(3 s、3&)#39; R)[5]ます。略称は(3)、(3)、(3)#39; s)異性体は自然界で最も一般的なアスタキサンチン配座であり、最も高い抗酸化活性を持つものであり、(3 r, 3&)が続く#39; r)および(3 s、3&)#39; R) conformations[6]。

アスタキサンチンは非常に高い応用価値がある。その長い共役ポリエン鎖は一重項酸素を消し、フリーラジカルを除去し、細胞活性を高め、人体の脂質を保護し、免疫力とアンチエイジングをある程度改善する。いくつかの研究は、そのアスタキサンチンを示しています'の抗酸化能力は、それが自然界で報告された最強の抗酸化物質作り、ビタミンcの6,000倍である[7-9]。同時に、高血圧、がん、肥満、心血管疾患、炎症性疾患、骨疾患、皮膚疾患などを含むほとんどの酸化ストレスと関連する炎症を防ぐことができるため、マルチターゲット製剤として使用することができます[10]。例えば、lignellら[11]は、アスタキサンチン含有薬を経口投与すると、筋力および運動持久力を有意に改善できることを示した。

Astaxanthでis also の自然coloring agent thでexists で異なる種でdifferent configurations, giving のbody のunique color。 The red colまたはの鮭meでis often のvisual treat that makes it easy にjudge のfreshness とflavor ののfood. In addition, アスタキサンチンcのalso be used としてのadditive でpoultry feed. Studies have shown that adding 10 mg/kg of自然アスタキサンチン にのfeed can effectively deposit it でのmeat のducks, giving the beaks とfeetのlive ducks のhealthy golden col分かったか?It can also improve the 酸化stability のmuscle lipids とmake them more nutritious [12].

アスタキサンチンはまた、環境植物の保護の役割を果たしています。例えば、アスタキサンチンはブドウの葉の光合成を促進し、ストレス耐性を高め、色を変化させる。その結果、現在、医療、化粧品、食品、飼料添加物、健康製品、農業などの分野での使用が増加しています(図2)[13-14]。世界のカロテノイド市場は、2017年に15億米ドルと評価され、2022年までに20億米ドルに達すると予測されています[15]。2番目に大きいカロテノイドであるアスタキサンチンの世界市場価値は、2027年までに34億ドル近くに成長すると予想されている[16]。

現在、アスタキサンチンの主な製造方法は、天然抽出、化学合成、微生物発酵である。天然抽出にはロブスター、カニ、その他の甲殻類廃棄物からのアスタキサンチンの抽出が含まれるが、収率が極めて低く、プロセスが複雑でコストがかかり、抽出プロセスは汚染されやすく、経済的に不可能である[17-18]。化学合成法は、長い生産サイクルと複雑なプロセスを有する[19]。合成産物は、様々な形状のアスタキサンチンの混合物と、様々な副生成物の蓄積である[20]。生体内での吸収・利用率は、天然に抽出されたアスタキサンチンに比べて低いため、人体への使用は認められていない[19]。

合成生物学技術の継続的な発展に伴い、微生物発酵を利用した天然物の生産は大きな可能性を示している[21-23]。微生物を用いて生産されるアスタキサンチンは、透明な形状であり、環境にやさしく、副生成物が少ないという利点がある[16]。したがって、これは非常に有望なアスタキサンチンの製造法である[18,24]。

Microorganisms currently used ためfermentative合成アスタキサンチン include algae, bacteria, yeast, etc. [25]. This paper discusses the latest progress でthe 生産のアスタキサンチンによってHaematococcuspluvialis, グルカンスクラーゼcoli, Xanthophyllomycesdendrorhous, Yarrowialipolyticaとother microorganisms, とsummarizes the 戦略ためscreening と代謝工学のastaxanthin-生産strains にincrease アスタキサンチン生産とreduce costs. Yarrowialipolyticaとother microorganisms to produce astaxanthin, the latest developments are discussed, とstrategies ためthe selectiにと代謝工学のastaxanthin-producingstrains to increase アスタキサンチン生産とreduce costs are summarized.

1 .アスタキサンチンの生合成経路

アスタキサンチンの生合成は、一般的に3つの段階に分けることができる[10]:

第一段階は中心炭素代謝であり、生物はグルコースと他の炭素源を利用して、embden-meyerhof-parnとして(emp)経路を介してピルビン酸とアシルcoaを生成する。これらはテルペン合成の前駆物質として用いられ、物質はテルペン合成の前駆物質としてメバロン酸経路(mva)とメチルエリトリトールリン酸経路(mep)に運ばれる。

mv aとmepはアスタキサンチン合成経路の第二段階である(図3)。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(i di)はippをジメチルアリルピロリン酸(dmapp)に異性化し、最後にippとdmappを前駆体としてテルペノイドの前駆体を合成する。m ep経路は、天然テルペノイドの前駆体を合成するための別の供給経路であり、細菌、真菌、植物、藻類に広く見られる。この経路はピルビン酸から始まり、dmappは7つの酵素反応で生成される。dmappは次にidiによってippに異性化され、最後にippとdmappはテルペノイド前駆体の前駆体として用いられる。

The third stage is the アスタキサンチン合成stage, でwhich IPPとDMAPPare converted to geranylgeranyl pyrophosphate (GPP) によってthe actiにのthe 酵素farnesyl diphosphate synthase (ispA). GP P continues to be 生産によってisp。Farnesyl pyrophosphate (FPP) is produced によってfarnesyl pyrophosphate synthase (CrtE), とgeranylgeranyl diphosphate (GGPP) is produced によってgeranylgeranyl diphosphate synthase (CrtE). ). GGPP is converted into lycopene によってthe action のthe octahydro-lycopene synthase/cyclase (phytoene synthase, lycopene cyclase) CrtYBとthe octahydro-lycopene desaturase (phytoene desaturase) CrtI. Lycopene is converted into β-carotene によってthe action のCrtYB.

間β-構造が違うのは構造が違うβ-caroteneでアスタキサンチンに嘘を探侦世纪末を告げるヒドロキシとカルボニル二団体炭素鎖。過程、βアスタキサンチンは製法に-caroteneヒドロキシとカルボニル二団体の端β-carotene分子だただし、合成経路は生物によって異なる場合がある。例えば、Pantoeaアスタキサンチン合成、主βを通じて-カロテノイドketolase(CrtW)とβ-carotene水酸化酵素CrtZ(チップ);Haematococcusでpluvialis、アスタキサンチンが主に合成してβ-carotenoid ketolase (BKT)とβ-carotene水酸化酵素CrtR(チップ);酵母赤系では、アスタキサンチンは主にcr trとcrtsによって合成される。別の設計酵母でアスタキサンチンも合成、β-caroteneketolaseとβ-carotene水酸化酵素。Tagetes erectaは现在植物が発声できるアスタキサンチンがカロテノイド4-hydroxyを合成すること-β

2アスタキサンチン合成シャシーセル

現在、微生物によるアスタキサンチン合成を改善するためには、発酵プロセスの制御や代謝工学による株の改変が一般的に用いられている。例えば、発酵条件を最適化することで微生物アスタキサンチンの生産を改善するなど。②供給を強化の前駆物質を強化するMVA、MEP代謝経路;試写③キー別のソースから遺伝子を説明する表现については図である。

④モジュール工表情遺伝子とコピーを提出数を増やす;

全ての細胞内小器官を局所化する。

2.1藻

Many algae でnature can produce astaxanthin, such as Haematococcus pluvialis, Chlamydomonas, Acetabularia, Euglena, etc. [26]. Haematococcus pluvialisis のfreshwater single-celled グリーンalga that can reach 5% アスタキサンチンcontent のthe セルdry weight. It is the maでalga ためアスタキサンチンproduction, とthe アスタキサンチンproduced によってHaematococcus pluvialisis the most antioxidant-rich levo (3S3&#【27】39;S)構成について説明する。しかし、haematococcus pluvialisは成長サイクルが長く、栽培要件が高く、光を必要とする。また、厚肉胞子にはアスタキサンチンが含まれており、抽出速度が低く、コストが高く、連続性が低い[19、28]。

アスタキサンチンの生産コストが高いため、大規模な使用には限界がある。そのため、製造コストを削減し、astaxanthin含有量を増加させることにより、商業化に向けた新規プロセスの開発が急務となっています。haematococcus pluvialisの成長には光が必要であるが、光の強度分布が不均一であり、光バイオリアクター内で混合されるため、藻類はバイオマスと二次代謝物の生産に影響を与える光と闇のサイクルの影響を受ける。Ranjbarら[29]の写真air-lift型光バイオリアクター設計、伝統的なバイオリアクター」に比べ、1年中フローは液体流通用浮雕文様が穏やかになればなるほど明暗サイクル、画一液体テルモミックス生产用中等老廃物の増加も大幅に増やすアスタキサンチン生産Haematococcus pluvialis。

上記の戦略に加えて、いくつかの外生物質を追加することもアスタキサンチンの生産を増加させるための実行可能な方法です。wangら[30]は、合成植物ホルモン類似体であるrac-gr24を添加することで、haematococcus pluvialisによるバイオマス産生とアスタキサンチンの蓄積を効果的に増加させることを見出した。rac-gr24は植物の光合成を促進し、炭水化物合成におけるco2の利用率を高め、バイオマスの蓄積を増加させることができます。また、nadphおよびペルオキシダーゼの過剰産生を促進し、活性酸素種による損傷を減少させる。加えて、haematococcus pluvialisのrac-gr24処理は、脂肪酸生合成およびアスタキサンチンエステル化経路の活性を変化させ、それによってアスタキサンチンの蓄積を増加させる。

Extracting アスタキサンチンからalgae is the biggest challenge because the hard とthick セルwalls 海藻類をincrease the mechanical とchemical resistance のthe cells. Traditional 抽出methods are not suitできためextracting アスタキサンチンからalgae. Therefore, Huang Wencan etアル[31]proposed a new 方法ためextracting アスタキサンチンからHaematococcus pluvialis 使用a switchable hydrophilic solvent. Dimethylamino cyclohexane (DMCHA) is a switchable hydrophilic solvent とlow volatility とsolubility. Using it, without the need ためdistillation, the extraction rate のアスタキサンチンからHaematococcus pluvialis can reach 87.2% によってsimply adding water とCO2 at the same time.

Haematococcus pluvialis is rich in 自然astaxanthin, unsaturated 脂肪acids, etc., とhas 高いresearch とutilization value [32]. At the same time, the demとためnatural astaxanthででdomestic とforeign markets is increasing, と◆development 潜在is huge. However, there are still several problems that need to be explored とsolved: ① The conversion のthe intermediate metabolites とthe 表情regulation の鍵酵素involved でthe 合成のアスタキサンチンによってHaematococcus pluvialis need to be further explored; ② Due to the complex セルwall structure のHaematococcus pluvialis, the extraction yield is low, とnew extraction processes still need to be developed でthe future to reduce 生産costs.

2.2酵母

アスタキサンチンを天然に生産する主な酵母はrhodotorula rubra、rhodotorula glutinis、r . benthicaなどである。合成生物学の発展により、遺伝子工学に基づいて作製された酵母はyarrowialipolytica、saccharomyces cerevisiae、kluyveromyces marxianusなどのアスタキサンチンを生産することもできる。酵母は、藻類や他の微生物と比較して、アスタキサンチン生産のための幅広い基質源、速い成長、短い発酵サイクル、比較的成熟した遺伝子改変ツールを持っています。したがって、酵母は現在、アスタキサンチンの工業生産のための最も有望なシャーシ細胞の一つである。

2.2.1 red fife酵母

赤酵母は、haematococcus pluvialisとともに、アスタキサンチンの工業生産に最も適した微生物であると考えられている[33-34]。さまざまな糖を炭素源としたアスタキサンチンを発酵・合成することができ[35]、細胞の成長速度が速く、成長周期が短いため、高密度栽培が可能で、生産コストを大幅に削減することができる[34,36]。同時に生成されるアスタキサンチンは(3 r, 3&)に含まれる#39; r)形状と容易に人体に吸収されます。そのため、ロドトルラはアスタキサンチン合成のための理想的なシャーシ細胞の1つとなった。表1にrhodotorulaのアスタキサンチン生産の最新の推移を示す。

発酵条件の最適化は、アスタキサンチン生産を増加させる最も簡単で直接的な方法です。これらの条件の中で、phは赤色酵母の増殖とアスタキサンチンの蓄積の両方に影響を与えます。いくつかの研究によると、酵母の赤血球増殖に最適な初期phは6.0、アスタキサンチン形成に最適なphは4.0、アスタキサンチン蓄積に最適なphは5.0である[37]。そのため、ph変調法を用いることで、一定のphでの発酵と比較して、glutinis rhodotorulaのアスタキサンチン産生量が24.1%増加した。そのため、発酵過程で特定の物質を添加することも、アスタキサンチンの生合成を促進することができます。

例えば、yang haoyiらは、シャーシ細胞として赤色酵母を用い[42]、プリン、ピリミジン、アミノ酸合成および解糖系の制御の低下がすべてアスタキサンチンの生合成に寄与し、脂質代謝経路の上昇がアスタキサンチンの蓄積に寄与していることを発見した。ナトリウムプロトポルフィリンの添加は、アミノ酸代謝経路を阻害し、19.2%のアスタキサンチン産生を増加させることができます;メラトニンの添加は脂質代謝を促進し、アスタキサンチンの生成を30.3%増加させる。

代謝フラックス解析により、ru yiら[41]は、エタノールがrhodaffia酵母の代謝におけるピルビン酸およびアセチル補酵素aの含有量を増加させ、それによってアスタキサンチン合成経路へのフラックス量を2.3倍に増加させ、それによってアスタキサンチン合成を促進することを発見した。同时に、αの代谢量が上がるノードアスタキサンチン合成経路-ketoglutaric酸と5-phosphoribosyl酸のを人を取り締まる。それは、発見さ0.5 g / Lα-ketoglutaric酸を培地が増えるかもしれ酵母赤色ファイフ酵母の成長0.4ことによって、セルg / Lを有する。培地に3 g/ lのグルタミン酸を添加すると、対照群の1.7倍である67.9 mg/ lのアスタキサンチンの生成量が増加した。

酵母は代謝能力が高く、単糖、二糖、多糖、有機酸などの低分子だけでなく、単純な窒素源や複雑な有機混合物も利用できることが知られています。産業廃棄物からの安価な基質を使用することで、バガスやスイートソルガムバガス(ssb)などのアスタキサンチン製造コストを効果的に削減することができます。zhuang yuanら[38]は、室温でのレッドファイフ酵母株およびuv変異誘発に関する研究を行った。育種後に得られた変異株をサトウキビのバガス加水分解液中で22°c、220 r/minで96時間発酵させたところ、カロテノイド濃度は88.57 mg/ lに達した。超音波とセルラーゼを用いて細胞壁をさらに破壊した後、アスタキサンチンの収率は96.01%に達した。stoklosaら[39]は、スイートソルガムバガスを炭素源として用い、rhodaff酵母を栽培してアスタキサンチンを生産した。しかし、フェノール化合物がSSBRhodaff酵母抑制し、抑圧によるSSBが緩和されたによる赤いごはん酵母SSBを重く扱う活性炭とlaccase、それでセル乾燥細菌はついにの重23.6センチに原稿gに15.6%からg / L/ L,アスタキサンチン制作は955 0.0469 mg / Lから占める48.9% mg / Lを有する。

合成生物学において、ターゲット生成物の含有量を増加させる最も一般的な方法は、依然として突然変異と代謝工学によるものである。gasselら[40]は、ランダムな変異導入により、アスタキサンチン含有量の高い赤色酵母株を得た。その上で、リコピンシクラーゼ遺伝子crtybと合成遺伝子asyを発現させることで、アスタキサンチン合成のフラックスをさらに増加させた。最終的に、発酵槽増幅実験により、最大で9.7 mg/g dcwに達した。別の研究では、エルゴステロール合成経路がフィードバックしてmva経路を阻害することが示されている。したがって、エルゴステロール合成に関与する遺伝子を削除することは、テルペンの生産を改善するための有効な戦略である。黄本ら[43]は、エルゴステロール生合成に関与するc-22ステロル・デサチュラーゼをコードする2つのcyp61遺伝子を順次削除し、発酵により、組換え赤色酵母rhodotorula glutinisのアスタキサンチン産生量が1.4倍増加することを確認した。

赤色酵母は、アスタキサンチンを天然に生産するシャーシ細胞の一つですが、野生型の赤色酵母は収量が低く分解しやすいため、大規模な工業生産には課題があります。したがって、現在の研究の第一の目標は、アスタキサンチン高収量株の選択である。将来的には、高収量株を選択するための変異原法、代謝工学、培地組成や発酵条件の最適化などにより、アスタキサンチンの更なる収量増加が期待されます。

Saccharomyces属cerevisiae2.2.2

saccharomyces cerevisiaeは全ゲノム塩基配列解読を行った最初の真核生物である。遺伝子操作が容易で、遺伝子発現制御のメカニズムが明確で、成熟した高密度発酵技術を有しています。特に、近年、saccharomyces cerevisiaeにおける経路の組み立てに適した一連のツールの開発は、合成生物学研究のための理想的なシャーシ細胞を作りました[44]。しかし、多くの人工酵母と同様に、野生型saccharomyces cerevisiaeはアスタキサンチンを合成できない。アスタキサンチン合成を達成するためには、アスタキサンチン合成の鍵となる遺伝子を導入して遺伝子操作する必要があります。合成されたアスタキサンチンの大部分は(3 s, 3&)である#39; S)設定です表2は、saccharomyces cerevisiaeによるアスタキサンチン生産の最新の進捗状況を示す。

異なる種のcrtzおよびcrtwは、saccharomyces cerevisiaeによるアスタキサンチンの合成に重要な影響を及ぼすため、外生のアスタキサンチン合成遺伝子とシャーシ細胞との適合性が特に重要である。wang ruizhaoら[45]は、saccharomyces cerevisiaeにおいて異なる種のcrtzとcrtwを組み合わせて発現させ、30の組み合わせからbrevundimonas vesicularisのcrtwとalcaligenesのcrtzを選択し、その結果得られた人工菌株sybe-sc118076までを生産した81.0 0.0469 mg / Lアスタキサンチン。また、重要な遺伝子の変異体をスクリーニングすることで、アスタキサンチンの生産量を増加させる効果的な方法もあります。

例えば、融合酵素の構築は、中間代謝物の蓄積を効果的に減らすことができる。リンカーを用いたcrtwとcrtzの融合に基づき、誘導進化によりアスタキサンチン産生量が増加した9種類の融合変異体が得られた。これらの優性変異体を組み合わせることで、対照株の3.8倍のアスタキサンチン含有量を持つ高収量のアスタキサンチン酵母l95s +1206 lが得られた[49-50]。

In order to improve the efficiency のβ-carotene conversion to astaxanthin, Zhou Pingping etアル[46]obtained superior 酵母mutants のcrtZとcrtWを通じてdirected coevolution, とat the same time introduced a Gal4M9-based temperature-responsive regulatory システム[51], decoupling アスタキサンチンsynthesis からcell growth coupling, i.e., the temperature was kept at 30 °Cでthe first phase to allow rapid cell growth; when the 細胞entered the log phase, the culture temperature was changed to 24 °Cto promote アスタキサンチンsynthesis; finally, 235 mg/L アスタキサンチンwas synthesized through two-phase high-density fermentation.

アスタキサンチンは脂溶性であるため、これはsaccharomyces cerevisiaeのようなモデル微生物の限られた脂質貯蔵容量と矛盾する[52]。したがって、脂質合成を促進して脂質液滴を拡大し、アスタキサンチン合成のためのより多くの貯蔵スペースを提供することで、アスタキサンチン含有量を増加させることができる。そこでli mingらは、3つの機能を持つcrisprシステムを用いて脂質代謝に関連する遺伝子のライブラリーをスクリーニングし[47,53]、脂質合成を促進するためにopi3とhrd1の発現レベルを適度に上昇させた。crtzとcrtwの発現バランスを調整した後、アスタキサンチン含有量は10.21 mg/g dcwに増加した。最後に、脂質合成の空間制御と温度応答の時間制御を組み合わせて、fed-batch発酵で446.4 mg/ lのアスタキサンチンを合成した。

2.2.3 Lipolytic酵母

脂肪分解酵母は最も広く研究され、使用されている非在来型酵母の1つである。脂肪分解酵母によって生産されるアスタキサンチンは、主に(3 s, 3&)に含まれる#39; S)設定です従来の酵母saccharomyces cerevisiaeと比較して、多種類のユニークな生化学的・代謝的特徴を有する。これは典型的なタイプii酵母で、細胞に有毒なエタノールを基本的に産生しない好気性細菌です[54]。また、細胞内には効率的なアセチル補酵素a代謝経路と高いトリカルボン酸サイクル流束があり、脂質の蓄積は77%に達する。これは、有機酸、脂質およびそれらの誘導体の工業生産に理想的です[55-57]。さらに、y . lipolyticaは、より低いphと高い浸透圧で成長することができ、糖、炭化水素、アルコール、脂質などのような様々な炭素源、タンパク質、疎水性基質を利用することができます。このため、成長環境が厳しくなく、さまざまな環境条件で成長することができ、産業応用の見通しも良好である[58]。表3にy . lipolyticaによるアスタキサンチン生産の最新の進捗状況を示す。

さまざまなソースからのアスタキサンチン生合成遺伝子は、y . lipolyticaにおけるアスタキサンチンの生産に影響を与える重要な要因である。Kildegaardら表わした[59]からcrtWParacoccusspだけど、N81106にからcrtZp ananatisでハイリスク・ハイリターンβ-carotene-producing y lipolytica离で最適化されのコピー番号、必要な関係の遺伝子コピーを最適化されたミッドレンジと3.5 mg / g DCW(、mg / L)アスタキサンチンが得られた。別の研究では3対のcrtWとcrtZ別のソースから、元々HpCrtWてる指摘とHpCrtZHaematococcusからpluvialisに言われた最強活動するβ-caroteneアスタキサンチン[65]。モジュール会議関連遺伝子によってペプチド[62]が浅く、盗聴内容からRIAD-RIDDと同時にコピー数を20に増やし、アスタキサンチン生産组换え作用酵母に達し3.3 g /サプリメントからビタミンc Lバッチ文化条件下は最高水準のアスタキサンチン総合までの微生物シャシーで。

微生物の高付加価値化学物質を生産するためのほとんどの代謝調節法は、反応容器として細胞質を使用します[66]。しかし、酵素や基質の分離や代謝クロストークは、細胞質での標的化合物の効果的な合成を妨げることが多い。真核細胞の細胞小器官の領域化は、このボトルネックの解決策となる。例えば、馬英碩ら。[60]だけでなくβの変換を速め-caroteneアスタキサンチンにも格段に小さくなりカロテノイドintermediatesを積み重ねていくということに場所アスタキサンチン合成経路endoplasmicレチクルperoxisomes、それによって141アスタキサンチン増産回していた。fed-batch発酵では、858 mg/ lのアスタキサンチンが合成できる。

アスタキサンチンは脂溶性のテルペン化合物であり、その疎水性が強いため生物学的利用能が低い。外部油相を添加することで、アスタキサンチンの溶解を促進し、結晶の生成を防ぎ、それによってアスタキサンチンの収率を増加させることができる。yuzbashevaらは、モジュール工学的手法と融合技術を用いて、587.3 mg/ lのアスタキサンチン生産量を有するリパセ欠乏遺伝子組換えsaccharomyces cerevisiae株を構築し、オイル層を加えることで973.4 mg/ lまでアスタキサンチン生産量を増加させることができた。

グリコシル化はまた、著しく増加させることができるアスタキサンチンの水溶性これにより生物学的利用能、光安定性、生物活性が向上する[67-68]。チンギョンら[63]植物性を建立astaxanthin-producing株カロテノイド4-hydroxyを-β-cyclodehydro-genase (HBFD)とカロテノイド-β-cyclodehydro-genaseから(CBFD)の遗伝子夏マリーゴールドPichia pastoris、アスタキサンチン346 0.0469 mg / Lの受益率。その上で、pantoea ananatis (p . ananatis atcc 19321)のゼアキサンチン糖転移酵素(crtx)遺伝子を発現させることにより、糖鎖付加アスタキサンチン合成経路を構築することに成功し、これまで報告されている微生物による糖鎖付加アスタキサンチン生産量の中で最高となる1.47 mg/ lの収率を達成した。

2.2.4 Kluyveromycesmarxianus

近年、kluyveromyces marxianusは天然物の合成に広く用いられている。他の伝統的な酵母と比較して、以下の利点があります。maxicruve酵母は、過剰な炭素源を提供することによって、細胞の生産を増加させることができます[69];maxicruve酵母の中には、高温に強く、25 ~ 52°cで発酵するものもある[70]。適切な糖鎖修飾と強いシグナルペプチドを持ち、saccharomyces cerevisiaeよりも高い分泌能力を持つ[71]。

現在、代謝工学的手法に基づき、マキシクルブ酵母をシャーシ細胞として用いてアスタキサンチンを合成しているが、合成されるアスタキサンチンの多くは(3 s, 3&)である#39; S)設定ですたとえば、lでyujuらは、maxicruve酵母にアスタキサンチンの異種合成経路を構築し、グルコースを用いたアスタキサンチン合成を達成した。そして、haematococcus pluvialisのhpchyb遺伝子とbkt遺伝子をsaccharomyces cerevisiaeのゲノムに組み込み、そのコピー数を増やして4つの修飾菌株を得た。さらに収量を向上させるために、hpchyb遺伝子に部位特異的変異を導入して酵素効率を改善し、ユビキチンによる異種タンパク質の分解を防止した。

これは結局、結果を合成するのに9972μg / g DCWアスタキサンチン5 L fermenter。別の研究では、xylose-inducible promoterと温度調節システムを使用することで、細胞の成長と生成物の合成をデカップリングすることができた。代謝経路および発酵条件をさらに最適化した結果、アスタキサンチンの生成量は56.8 mg/ lであった[73]。アスタキサンチン製造のためのシャーシ細胞としてマキシクルビン酵母を使用することに関する報告はほとんどありませんが、そのユニークな利点は、アスタキサンチンの微生物発酵と合成のための新しい技術的選択肢を提供します。

2.2.5他の酵母

上記の代表的な遺伝子組み換え酵母以外にも、rhodotorula mucilaginosaや海洋red yeastなどの酵母によるアスタキサンチンの生産に関する報告は比較的少ない。Rhodotorula mucilaginosa入りの赤い酵母石油・は主に用いられるに生産をβ-carotene。でチームを得astaxanthin-producingの変種ウィルスRhodotorula mucilaginosa RG-31変異原を通じて試写そして最適化の発酵アスタキサンチンを成し遂げることが条件内容は126.6μg / mL海紅酵母は、海に自然に存在する単細胞酵母の一種です。耐塩性に優れ、カロテノイド、主にアスタキサンチンを産生する。砂海洋感のある酵母S8濃い赤色を高いカロテノイド制作紫外線入手した変異原を取得株ST5で送り発酵を最適化することで,条件が取れるアスタキサンチンコンテンツ520μg / g。

2.3細菌

細菌によるアスタキサンチンの生産量が少ないため、国内外の藻類や菌類を中心に研究が行われており、細菌による合成に関する研究は比較的少ない。ほとんどの細菌のアスタキサンチン含有量は、一部の藻類や菌類に比べてはるかに低いが[20]、細菌にアスタキサンチン合成に関連する遺伝子を導入すると、アスタキサンチンの生産が大幅に増加する。また、菌類や藻類に比べ、細菌発酵を利用することで抽出が容易になり、その後の抽出工程が大幅に簡素化される。特にグラム陰性菌は細胞壁が薄く壊れやすいため、細胞からのアスタキサンチンの抽出が容易である。そのため、細菌発酵によるアスタキサンチンの生産は、アスタキサンチンの生産コストを大幅に下げることができ、今後の工業生産に大きな意味を持つ。

大腸菌2.3.1

大腸菌(escherichia coli)はグラム陰性の嫌気性細菌である。栽培が容易で、操作が簡単で、安価で、成熟した分子遺伝学的修飾ツールを備えています。これは、代謝工学と合成生物学のための最良のホストの一つとなっています。非カロテノイド産生株として、mep経路を介してテルペン化合物前駆体ippおよびdmappを合成することができる。野生型の大腸菌では、ippとdmappを濃縮してgppとfppを生成できるが、fppを最終的なアスタキサンチンに変換する酵素は存在しない。そこで、外生のアスタキサンチン合成モジュールを大腸菌に導入することにより、比較的容易にe . coli内でアスタキサンチンを合成することができ、合成されたアスタキサンチンはほとんどlevorotatory (3 s, 3&)にあります#39; S)設定です表4に大腸菌のアスタキサンチン生産の最新の推移を示す。

アスタキサンチンの代謝合成経路における重要な遺伝子が同定されたことで、高いアスタキサンチン産生を有する人工細菌を構築することが可能となった。[75]koocuria gwangallensisからのmep経路を用いてdxs、ispc、ispd、ispe、ispf、ispg、isphおよびidiを共発現させ、アスタキサンチン合成の変換に関与する遺伝子(crti、crte、crtyb、crtw、crtz)を大腸菌で共発現させてアスタキサンチン産生を増加させた。この人工非メバロン酸経路の遺伝子(dna)が入っていた大腸菌が合成1100μg / g DCWのアスタキサンチン。イソプレノイド経路のlytb、ispa、idi遺伝子はipp、dmapp、fppの合成に必須である。しかし、大腸菌自身はこれらの前駆体を自身の成長ニーズを満たすためにしか合成できず、アスタキサンチン合成経路に向かわせることができないため、アスタキサンチンの収率は低すぎる。このため、李ら過剰発現したとき[76]lytB、ispAアスタキサンチン合成機を積載していな大腸菌内に合成され遺伝子(crtI、crtE、crtYB、crtW crtZ)、そして最終的に大腸菌人工合成1200μg / g DCWアスタキサンチン。異なるソースからのcrtwおよびcrtzのスクリーニングは、アスタキサンチン生産を改善するためのルーチンの方法の1つである。

たとえば、luら[78]は、異なるソースからのcrtwとcrtzを比較し、brevundimonas sp. sd212からのcrtwとpantoea agglomeransからのcrtzがアスタキサンチン生産に最適な組み合わせであると結論付けた。crtwとcrtzの発現活性のバランスをとることで、プラスミドや抗生物質マーカーを持たない大腸菌asta-1株を作製した。誘導剤を添加しなかった場合、組換え株はカロテノイドの96.6%をアスタキサンチンとして合成し、7.4 mg/gのdcwに達した。呉楊元慶ら[79]上映9 crtZその別のソースからcrtWしてご绍介にまして高い大腸菌β-carotene生産アスタキサンチン内容はmg / L 0.49-8.07 mg / L世帯となっている。その後、最適化されたペプチドリンカーを用いてcrtzとcrtwを融合させ、さらにアスタキサンチンの生産量を127.6%増加させた。

li shunら[80]は、gadeプロモーターを選択することによって、大腸菌でhaematococcus pluvialisのhpchy遺伝子と、chlamydomonas reinhardtiiのcrbkt遺伝子を発現させた。最終的に、24.16 mg/ lのアスタキサンチンを合成することができました。このことは、アスタキサンチン合成に適切な遺伝子要素を選択することが、アスタキサンチンの発現量に大きな影響を与えることを示しています。

キー遺伝子のコピー数を増やすことは、簡単で直接的で効果的なアスタキサンチン産生を増やす方法です。例えば、大腸菌では、crtybのコピー数を増やすことで、不十分なアスタキサンチン蓄積のボトルネックを解消し、プロモーターの発現を調節することで、fed-batch発酵条件下での最終的なアスタキサンチン生産量は1.18 g/ lに達した[20]。

李廸ら[82]初演ランダム変異する行事crtW化從而提β-caroteneアスタキサンチンにそしてコピーcrtW増えCre-loxP製法にcrtZ大腸菌の兵営地とする目的で城郭建造とアスタキサンチン生産高と…最終的に、fed-batch発酵により、アスタキサンチンの生産量は0.88 g/ lに達した[84]。zhang mengら[83]は、paracoccus sp. pc1由来のcrtzとpantoea agglomerans由来のcrtzの共発現がアスタキサンチンおよび中間体の蓄積を増加させることを見出した。最後に、遺伝子組換え大腸菌株pacrtz 2本とpccrtz 1本を持つ遺伝子組換え大腸菌株を作製した。fed-batch発酵70時間後、アスタキサンチンの生産量は1.82 g/ lに達した。

さらに、従来とは異なる技術的方法でアスタキサンチン代謝経路を増強する戦略は、アスタキサンチン産生の増加という目標を達成するためにも使用できます。例えば、パートナーco-expressing遺伝子によってApcpnAアスタキサンチン合成遺伝子を表現ApcpnB大腸菌内に合成され(crtI、crtE、crtYB、crtW crtZ)、产できる最終遺伝子組み換え細菌890μg / g DCWのアスタキサンチン[74]。Lemuthら[77]国産第1 plasmid-free? ?大肠菌と融合安定的なアスタキサンチン生の遺伝子(dna)経路を通じて大腸菌染色体にγ歩道組み換え技術だけでその経路アスタキサンチン合成を指さした。最終的なアスタキサンチン含有量は1.4 mg/gのdcwに達した[85]。形態学に基づく酸化ストレス工学は、大腸菌におけるアスタキサンチン合成を改善するための効果的な戦略でもある。例えば、形態や膜に関連する遺伝子を削除すると、細胞が大きく長くなり、アスタキサンチンの蓄積が増加する。

酸化ストレスとは、細胞内で活性酸素と抗酸化物質の産生が不均衡になり、細胞を損傷させることです。したがって、酸化ストレスに関連する遺伝子を削除することで、細胞内の活性酸素の量を増やし、細胞を保護することができます[81]。また、温度上昇後も細胞形態は変化し、活性酸素の濃度も高くなります。したがって、温度感受性プラスミドの相補的な発現系を確立することにより、この大腸菌株のアスタキサンチン含有量を最終的に11.92 mg/g dcwまで増加させることができます。さらに、酵素の局在戦略を用いて、遺伝子操作された大腸菌におけるアスタキサンチンの生産量を増加させることもできる。例えば、叶丽君ら。【86-88】昔の言葉にあわせてβれることが現地化大腸菌タグ-caroteneだろdioxygenase異なるセルにPhCCD1た結果、触媒効率はレストボックス最適な膜。最後に、crtwとcrtzをglpfタンパク質を介して大腸菌細胞膜に融合させたところ、アスタキサンチン産生量が215.4%増加した。

2.3.2 Paracoccus

パラコクス(paracoccus sp.)は、アスタキサンチンやその他の希少カロテノイドを細胞内に含む好気性グラム陰性細菌である。しかし、パラコクスにおけるアスタキサンチン合成に関する研究論文はほとんどない[89-90]。天然のカロテノイドは通常、ヒトや動物の生物学的利用可能性が低いe配置に存在する。「z異性化」は、それらの生物学的利用能を高める有効な手段である[91-93]。例えば、hondaら[94]は、亜臨界水条件下(水を沸点以上、臨界点以下に加熱し、システムの圧力を制御して水を液体状態に保つ)で、コクコリソフォアをシャシーセルとして、アスタキサンチンなどのカロテノイドを異性化する。加熱・加圧条件下でエタノールを添加すると、「z異性化」の効率が大幅に向上することがわかりました。加圧条件下では、「z異性化」の効率が大幅に向上した。最終的に、30分間の亜臨界水処理の結果、カロテノイド分解を抑制しながら、z異性化比50%以上のアスタキサンチンが得られました。

発酵中の培地組成やパラメータを適切に調整することは、アスタキサンチンの生産量を増やすための有効な方法です。トリカルボン酸中間体を培地に添加すると、前駆体の供給が促進される。また、アスタキサンチン合成における主要酵素の補因子(硫酸鉄、アスコルビン酸、nadph、atp、2-オキソグルタル酸)を加えることにより、アスタキサンチンの蓄積を増加させることにより、主要酵素の活性を高めることができる。例えば、は芽胞てアスタキサンチンを輩出したシャシーに活動Crt酵素を増やし5 mmol / Lリンゴ酸を加え、加水分解mmol 1 / L硫酸第一鉄、アスタキサンチン増産177μg / Lから3750μg / L [95]細菌自身によるアスタキサンチンの生産量は藻類や酵母によるものよりも少ないが、その後の遺伝子改変株の構築や改変のための代替遺伝子要素を提供する。

別の細菌2.3.3

アスタキサンチンを産生する細菌は比較的少なく、収量も比較的低い。最も研究されているのは、シャーシ細胞としての大腸菌である。また、乳酸菌(mycobacterium lacticola)やベビバクテリウム属(bevibacterium)もアスタキサンチンを産生する。しかし、mycobacterium lacticolaは炭化水素培地上でのみアスタキサンチンを生成し、栄養素培地上では生成しません。ベビバクテリウム属は油中で生育し、発酵終了時のバイオマスはわずか3 g/ lで、アスタキサンチン含有量はさらに低くなります。

要約すると、大腸菌は現在、細菌の間でのアスタキサンチン生産にとって理想的なシャーシ細胞である。

3 .アスタキサンチンの抽出工程

アスタキサンチンは細胞内生成物であるため、微生物からの抽出は細胞破壊と収集の2段階に分けられる。細菌に比べて、藻類や酵母の細胞壁は硬くて厚く、壊れにくいため、製品の抽出が難しい。そのため、アスタキサンチン抽出の焦点は細胞壁破壊である[96]。

細胞壁を破壊する従来の方法には、主に物理的、化学的、および酵素的な方法があります[97]。物理的方法には、機械破砕、超音波破砕、超臨界流体抽出などがあります。機械破砕は操作が簡単で、細胞壁を機械的な攪拌によって引き裂き、細胞内にアスタキサンチンを放出する。しかし、機械破砕は場所によっては高温を引き起こし、ある程度アスタキサンチンを損傷させる可能性があります。超音波破砕は溶質内の細胞壁を効果的に破壊することができるが、超音波作用の強度と持続時間が増加すると、高度に酸化するフリーラジカルの生成が増加し、アスタキサンチンの抽出速度が低下する。超臨界流体抽出法は、様々な藻類製品を抽出するために近年最も有効な抽出法である。従来の液体溶剤と比較して、高い拡散率、高い圧縮率、低い表面張力、低粘度、細胞壁の容易な浸透などのいくつかのユニークな物理的および化学的性質を有し、製品の抽出効率を向上させる。

化学methods mainly include 有機solvent extraction, acid-base treatment, とdimethyl sulfoxide (DMSO) methods. Astaxanthでis a fat-soluble natural product, so the choice のorganic solvent must take into account whether アスタキサンチンis soluble and the polarity のthe solvent. For example, Xing Tao etアル[99]used ethyl acetate as an organic solvent to extract アスタキサンチンからHaematococcus pluvialis, and the final yield was 98.51%. Although the use のorganic 溶剤to extract astaxanthでhas a high yield, the downside is that many solvents are toxic and may have a damaging effect on astaxanthin. Acid-base treatment involves the use の大型quantities のacid and alkali reagents, which may not only damage アスタキサンチンbut also cause 対応するenvironmental pollution. Dimethyl sulfoxide is a polar solvent that is soluble でboth water and organic solvents. It is a commonly used solvent ためbreaking cell walls でthe laboratory, as it can quickly and efficiently break the cell walls のbacteria without significantly affecting アスタキサンチン[100]. When mixed とacetone でthe right proportions, it can also extract アスタキサンチンrelatively completely [101].

酵素によるアスタキサンチン抽出には、温和な条件、低エネルギー消費、短い処理時間という利点がある。迅速かつ効率的に細胞壁を破壊し、細胞からアスタキサンチンを放出するだけでなく、細胞の活性を阻害して細胞内物質の変性を防ぐ[102]。そのため、酵素法で抽出されたアスタキサンチンは、他の方法で抽出されたアスタキサンチンよりも安定である。例えば、β-glucanaseはhydrolyzeβ-glucan細胞壁、アスタキサンチンの玉こぼれを防ぐことができ损失バクテリアと减らすこと[100]。しかし、この酵素法は多量の酵素を必要とし、生産コストが上昇することは間違いありません。一方、酵素は本来タンパク質であるため変性しやすく、大規模なアスタキサンチン抽出には適していません。

アスタキサンチンは強力な抗酸化物質であるため、空気に長時間さらされると、空気中の酸素がアスタキサンチンと反応して抗酸化力を失う。したがって、無酸素(窒素を充填した)抽出プロセスも、現在の工業生産では利用できないステップの1つです。この方法では、不活性ガスまたは窒素を充填することで無酸素環境で有機溶媒を抽出することができ、その活性を保護し、アスタキサンチンの抗酸化活性を大幅に向上させることができます。

4まとめと展望

アスタキサンチンは、食品、医薬品、化粧品などの分野で幅広く使用されており、今後も需要の拡大が見込まれています。現在、アスタキサンチンの主な生産方法は化学合成だが、化学合成には限界があるため、世界各国での化学合成管理が厳しくなっている。しかし、天然資源から直接抽出されるアスタキサンチンは、消費者の需要を満たすことが難しい。

したがって、微生物発酵によるアスタキサンチンの工業生産は有望な選択肢である。酵母は、基質スペクトルが広いこと、培養が容易であること、発酵サイクルが短いこと、遺伝子改変ツールが比較的成熟していることなどの利点から、最も有望なシャーシ細胞である。このうち、ロドプセウドモナスは天然にアスタキサンチンを生産する能力があり、成長が早く、多様な炭素源を利用できる。ヤロウィアlipolyticaは、高アセチル補酵素aフラックスとトリカルボン酸サイクル代謝経路を持って、低いphと高い浸透圧で成長することができます;saccharomyces cerevisiaeは、遺伝子操作が容易で、遺伝子発現を制御するメカニズムが明確で、成熟した高密度発酵技術を持っている。ピヒア・パストリスは高温に耐えることができ、適切なグリコシル化が行われ、強力なシグナル・ペプチドを持つ。

合成生物学、タンパク質工学、代謝工学、発酵工学の急速な発展に伴い、多くの微生物がシャシー細胞として使用され、アスタキサンチンが生産されている。しかし、アスタキサンチン生合成に大きな進歩があったにもかかわらず、課題は残っている。

第一に、アスタキサンチンを自然に生産できるrhodotorula glutinisやhaematococcus pluvialisなどの微生物は、生産量が少なく、培養条件が厳しく、コストが高いという問題点がある。この問題を解決するためには、今後、高収量株の栽培とスクリーニング、および収量増加とコスト削減のための培養条件の最適化に注力する必要があります。

第二に、アスタキサンチン合成の複雑な同化経路のため、大腸菌、lipomyces starkeyi、saccharomyces cerevisiaeなどのモデル生物の代謝工学における収率が低いなどの問題がある。そのため、シャーシ細胞でのアスタキサンチン合成効率を向上させるためには、以下のような方法が考えられます(図4)。例えば、切断されたthmg (n末端で500アミノ酸で切断されたもの)は、mva経路の重要な遺伝子であることが示されている。それは効果的にそれ自身の分解を防ぐことができ、それによってカロテノイドの生産を増加させる。

(2) 異なる強度のプロモーターを置換することで、代謝経路における触媒マッチングが改善される。例えば、βの遺伝子も-carotene生、力強いポーズ代わり発起人PTEF他無力な発起人に名を大きく低下させ、β-carotene生産Yarrowialipolytica[103]。

③上げるため遺伝子コピー番号の暗号鍵を増やしrate-limiting界代謝磁束は階段を上がった。例えば、コピーcrtYB数から1 ~ 4人に増えたが、β-carotene[104]増産された76%カットする。

④モジュール組立鍵遺伝子と異なる枡を用いるリンカーその他短いペプチドている炭素代謝を改善流動的です不安アスタキサンチンのを高めた。

全ての細胞内小器官に局在し、アスタキサンチンの貯蔵空間を増加させる。カロテノイドは一般的に細胞膜に貯蔵され、細胞膜の流動性を低下させ、細胞死を引き起こす可能性がある。細胞内小器官におけるカロテノイドの代謝経路のローカライズは、代謝障害を減らすことができます代謝障害。同時に、それはまた、細胞内のカロテノイドの貯蔵空間を拡張することができ、細胞への毒性を減少させる。例えば、真核細胞の小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシソームは、カロテノイドの合成に有利な条件を提供する独特の物理的環境を持っている。

⑥発酵と条件最適化は、最も一般的な増産を誘導する最も効果的な手段アスタキサンチンです例えば、異なる炭素源と窒素源、異なる炭素比と窒素比、ph値、温度制御を使用して用土を最適化します。

It is also worth noting that even though astaxanthでproduced through 生has far greater アプリケーションvalue than that produced through chemical synthesis, ◆application is still restricted by the laws and regulations のmany countries. For example, the USFDA prohibits the use のアスタキサンチンas a food additive because prolonged heating のアスタキサンチンcan produce carcinogens. France clearly stipulates that アスタキサンチンcan only be used でspecific 健康products and cosmetics. Therefore, there is still a long way to go before astaxanthでcan be produced through 微生物fermentation.

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