微生物発酵法によるアスタキサンチンの合成に関する研究

アスタキサンチンはオレンジ色のケト型カロテノイドである分子式c40h52o4、化学名3,3&で表される#39; -dihydroxy-4、4' -dione-beta、beta' -carotene[2]。アスタキサンチンは、水に不溶で、脂溶性で、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、二硫化炭素などの有機溶媒に可溶で、メタノールやエタノールなどの極性有機溶媒にはわずかに可溶です[3]。アスタキサンチンは、8つのイソプレン単位が共役二重結合で結合したテトラテルペノイドであり、共役二重結合の末端に不飽和ヒドロキシル基とケトン基がある[4]。そのため、アスタキサンチンは以下のような異なる構造を持つ(図1)#39; s)、デextrorotary (3 r、3' r)およびラセミ(3 s、3&)#39; R)[5]ます。略称は(3)、(3)、(3)#s)の異性体が最も多い自然界では一般的なアスタキサンチン構造そしてまた、最も高い抗酸化活性を持つもので、(3 r, 3' r)および(3 s、3&)#39; R) conformations[6]。

アスタキサンチンは非常に高い用途がある価値がある。その長い共役ポリエン鎖は一重項酸素を消し、フリーラジカルを除去し、細胞活性を高め、人体の脂質を保護し、免疫力とアンチエイジングをある程度改善する。いくつかの研究は、そのアスタキサンチンを示しています'の抗酸化能力は、それが自然界で報告された最強の抗酸化物質作り、ビタミンcの6,000倍である[7-9]。同時に、高血圧、がん、肥満、心血管疾患、炎症性疾患、骨疾患、皮膚疾患などを含むほとんどの酸化ストレスと関連する炎症を防ぐことができるため、マルチターゲット製剤として使用することができます[10]。例えば、lignellら[11]は経口投与を示したastaxanthin-containing薬筋力と運動耐久性を大幅に向上させることができます。

アスタキサンチンは、異なる種に存在する天然の着色剤でもある体に独特の色を与えます鮭の肉の赤い色は、多くの場合、食品の鮮度や風味を判断するのが簡単に視覚的な治療です。加えて、アスタキサンチンは鶏肉の飼料に添加剤として使用することもできる。研究によると、飼料に天然のアスタキサンチンを10 mg/kg加えると、アヒルの肉に効果的に沈着し、生きているアヒルのくちばしと足に健康な黄金色を与えることができます。また、筋肉脂質の酸化安定性を改善し、栄養価を高めることもできます[12]。

アスタキサンチンはまた、環境植物の保護の役割を果たしています。例えば、アスタキサンチンスプレーブドウの葉の光合成を増やし、ストレス耐性を高め、色を変えることができる。その結果、現在、医療、化粧品、食品、飼料添加物、健康製品、農業などの分野での使用が増加しています(図2)[13-14]。世界のカロテノイド市場は、2017年に15億米ドルと評価され、2022年までに20億米ドルに達すると予測されています[15]。のアスタキサンチンの世界市場価値2番目に大きいカロテノイドは、2027年までに34億ドル近くに成長すると予想されている[16]。

現時点では、メインアスタキサンチンの製造方法には自然抽出がある化学合成と微生物発酵です天然抽出にはロブスター、カニ、その他の甲殻類廃棄物からのアスタキサンチンの抽出が含まれるが、収率が極めて低く、プロセスが複雑でコストがかかり、抽出プロセスは汚染されやすく、経済的に不可能である[17-18]。化学合成法は、長い生産サイクルと複雑なプロセスを有する[19]。合成産物は、様々な形状のアスタキサンチンの混合物と、様々な副生成物の蓄積である[20]。生体内での吸収・利用率は、天然に抽出されたアスタキサンチンに比べて低いため、人体への使用は認められていない[19]。

合成生物学技術の継続的な発展に伴い、微生物発酵を利用した天然物の生産は大きな可能性を示している[21-23]。微生物を用いて生産されるアスタキサンチンは、透明な形状であり、環境にやさしく、副生成物が少ないという利点がある[16]。したがって、これは非常に有望ですアスタキサンチンの製造方法[18、24]大人。

現在使用されている微生物アスタキサンチンの発酵合成には、藻類、細菌、酵母が含まれますなど[25]。本論文では、haematococcus pluvialis、escherichiのcoli、xanthophyllomyces dendrorhous、yarrowiのlipolyticaおよび他の微生物によるアスタキサンチン生産の最新の進捗状況を説明し、アスタキサンチン生産を増加させ、コストを削減するためのアスタキサンチン生産株のスクリーニングと代謝工学の戦略を概説する。本論文では、ヤロウィア・リポリチカおよびその他の微生物によるアスタキサンチン生産について、最新の開発状況を紹介し、生産量の増加とコスト削減を目的としたアスタキサンチン生産株の選択と代謝工学の戦略について概説する。

1 。アスタキサンチンの生合成経路

アスタキサンチンの生合成は、一般的に3つの段階に分けることができる[10]:

第一段階は中心炭素代謝であり、生物はグルコースと他の炭素源を利用して、embden-meyerhof-parnとして(emp)経路を介してピルビン酸とアシルcoaを生成する。これらはテルペン合成の前駆物質として用いられ、物質はテルペン合成の前駆物質としてメバロン酸経路(mva)とメチルエリトリトールリン酸経路(mep)に運ばれる。

mv aとmepは第2段階であるアスタキサンチン合成経路mva経路は、テルペン合成に必要な前駆体だけでなく、細胞の成長に必要な物質の前駆体でもある。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(i di)はippをジメチルアリルピロリン酸(dmapp)に異性化し、最後にippとdmappを前駆体としてテルペノイドの前駆体を合成する。m ep経路は、天然テルペノイドの前駆体を合成するための別の供給経路であり、細菌、真菌、植物、藻類に広く見られる。この経路はピルビン酸から始まり、dmappは7つの酵素反応で生成される。dmappは次にidiによってippに異性化され、最後にippとdmappはテルペノイド前駆体の前駆体として用いられる。

の第三段階はアスタキサンチンの合成であるstageは、ippとdmappがファルネシル二リン酸合成酵素(ispa)の作用によりゲラニルゲラニルピロリン酸(gpp)に変換される。ispaではgp pが生産されている。ファルネシル二リン酸(fpp)はファルネシル二リン酸合成酵素(crte)によって、ゲラニルゲラニル二リン酸(ggpp)はゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素(crte)によって生産される。。ggppは、オクタヒドリコピン合成酵素/シクラーゼ(フィトエンシンターゼ、リコピンシクラーゼ)crtybとオクタヒドリコピンデサチュラーゼ(フィトエンデサチュラーゼ)crtiの作用によってリコピンに変換される。リコピンはβに変換されての作用によって-carotene达さCrtYB。

間β-構造が違うのは構造が違うβ-caroteneそして、アスタキサンチンは、炭素鎖の末端にある環のヒドロキシル基とカルボニル基に位置しています。過程、βアスタキサンチンは製法に-caroteneヒドロキシとカルボニル二団体の端β-carotene分子だただし、合成経路は生物によって異なる場合がある。例えば、Pantoeaアスタキサンチン合成、主βを通じて-カロテノイドketolase(CrtW)とβ-carotene水酸化酵素CrtZ(チップ);Haematococcusでpluvialis、アスタキサンチンが主に合成してβ-カロテノイドketolase (BKT)とβ-carotene水酸化酵素CrtR(チップ);酵母赤系では、アスタキサンチンは主にcr trとcrtsによって合成される。別の設計酵母でアスタキサンチンも合成、β-caroteneketolaseとβ-carotene水酸化酵素。Tagetes erectaは现在植物が発声できるアスタキサンチンがカロテノイド4-hydroxyを合成すること-β

2アスタキサンチン合成シャシーセル

現在、微生物によるアスタキサンチン合成を改善するためには、発酵プロセスの制御や代謝工学による株の改変が一般的に用いられている。受注生産(受注生産)微生物アスタキサンチンproduction発酵条件を最適化することで②供給を強化の前駆物質を強化するMVA、MEP代謝経路;試写③キー別のソースから遺伝子を説明する表现については図である。

④モジュール工表情遺伝子とコピーを提出数を増やす;

全ての細胞内小器官を局所化する。

2。1藻

多く自然界の藻類はアスタキサンチンを生成することができます例えば、haematococcus pluvialis、クラミドモナス、acetabularia、ミドリムシなど[26]。ヘマトコッカス・プルビアリス(haematococcus pluvialis)は淡水の単細胞緑色の藻で、細胞乾燥重量の5%のアスタキサンチン含有量に達する。アスタキサンチンを生産する主要な藻類である学名はhaematococcus pluvialis最も抗酸化物質が豊富なレボ(3 s, 3&#【27】39;S)構成について説明する。しかし、haematococcus pluvialisは成長サイクルが長く、栽培要件が高く、光を必要とする。また、厚肉胞子にはアスタキサンチンが含まれており、抽出速度が低く、コストが高く、連続性が低い[19、28]。

コストの高さヘマトコッカス・プルビアリス(haematococcus pluvialis)アスタキサンチンの生産その大規模な適用を制限します。そのため、製造コストを削減し、astaxanthin含有量を増加させることにより、商業化に向けた新規プロセスの開発が急務となっています。haematococcus pluvialisの成長には光が必要であるが、光の強度分布が不均一であり、光バイオリアクター内で混合されるため、藻類はバイオマスと二次代謝物の生産に影響を与える光と闇のサイクルの影響を受ける。ranjbarら[29]は、従来のバイオリアクターと比較して、液体循環のより規則的な流れパターンを持ち、より安定した明暗サイクル、より均一な液体混合、二次代謝物の産生増加、および大幅な増加をもたらすエアリフト光バイオリアクターを設計した学名はhaematococcus pluvialis。

上記の戦略に加えて、いくつかの外生物質を追加することもアスタキサンチンの生産を増加させるための実行可能な方法です。wangら[30]は、合成植物ホルモン類似体であるrac-gr24を添加することで、haematococcus pluvialisによるバイオマス産生とアスタキサンチンの蓄積を効果的に増加させることを見出した。rac-gr24は植物の光合成を促進し、炭水化物合成におけるco2の利用率を高め、バイオマスの蓄積を増加させることができます。また、nadphおよびペルオキシダーゼの過剰産生を促進し、活性酸素種による損傷を減少させる。さらに、haematococcus pluvialisのrac-gr24治療は、脂肪酸生合成およびアスタキサンチンエステル化経路の活性を変化させ、それによって増加させるアスタキサンチンの積み重ね。

藻類の硬く厚い細胞壁は、細胞の機械的・化学的抵抗性を高めるため、藻類からアスタキサンチンを抽出することが最大の課題となっている。従来の抽出方法は適していません藻類からアスタキサンチンを抽出する。したがって、huang wencanら[31]は、ahaematococcus pluvialisからアスタキサンチンを抽出する新しい方法交換可能な親水性溶媒を使ってジメチルアミノシクロヘキサン(dimethylamino cyclohexane, dmcha)は、揮発性と溶解性が低い切り替え可能な親水性溶媒である。蒸留を必要とせず、水とco2を同時に加えるだけで、haematococcus pluvialisからのアスタキサンチン抽出率は87。2%に達する。

haematococcus pluvialisは天然のアスタキサンチンや不飽和脂肪酸などが豊富で、研究と利用価値が高い[32]。一方、天然アスタキサンチンの国内外市場での需要は増加しており、その開発潜在力は大きい。しかし、まだ調査し、解決する必要がありますいくつかの問題があります。その中間代謝物の変換やhaematococcus pluvialisによるアスタキサンチンの合成に関与する主要な酵素の発現調節を検討する必要があります。②Haematococcusが細胞壁が复雑構造のためpluvialis、抽出が低いの平均収益率を記録し、新しい抽出方法なに使われる燃料電池を開発する未来を生産コストを引き下げる。

2.2酵母

アスタキサンチンを天然に生産する主な酵母はrhodotorulのrubra、rhodotorulのglutinis、r . benthicaなどである。合成生物学の発展により、遺伝子工学に基づいて作製された酵母はyarrowiのlipolytica、saccharomyces cerevisiae、kluyveromyces marxianusなどのアスタキサンチンを生産することもできる。酵母は、藻類や他の微生物と比較して、アスタキサンチン生産のための幅広い基質源、速い成長、短い発酵サイクル、比較的成熟した遺伝子改変ツールを持っています。したがって、酵母は現在、アスタキサンチンの工業生産のための最も有望なシャーシ細胞の一つである。

2.2.1 red fife酵母

赤酵母は、haematococcus pluvialisとともに、自然界で最も適した微生物であると考えられているアスタキサンチンの工業生産[33-34]。さまざまな糖を炭素源としたアスタキサンチンを発酵・合成することができ[35]、細胞の成長速度が速く、成長周期が短いため、高密度栽培が可能で、生産コストを大幅に削減することができる[34,36]。同時に生成されるアスタキサンチンは(3 r, 3&)に含まれる#39; r)形状と容易に人体に吸収されます。したがって、シャクナゲは理想の一つとなったアスタキサンチン合成のためのシャーシ細胞。表1にrhodotorulaのアスタキサンチン生産の最新の推移を示す。

発酵条件の最適化は、アスタキサンチン生産を増加させる最も簡単で直接的な方法です。これらの条件の中で、phは両方の成長に影響を与えます赤派閥酵母細胞とアスタキサンチン蓄積。いくつかの研究によると、酵母の赤血球増殖に最適な初期phは6.0、アスタキサンチン形成に最適なphは4.0、アスタキサンチン蓄積に最適なphは5.0である[37]。そのため、ph変調法を用いることで、一定のphでの発酵と比較して、glutinはrhodotorulaのアスタキサンチン産生量が24.1%増加した。そのため、発酵過程で特定の物質を添加することも、アスタキサンチンの生合成を促進することができます。

例えば、yang haoyiらは、赤色酵母をシャーシ細胞として用い[42]、プリン、ピリミジン、アミノ酸合成、解糖系の経路の低下がすべて寄与していることを発見したアスタキサンチン生そして、脂質代謝経路の上昇がアスタキサンチンの蓄積を助けた。ナトリウムプロトポルフィリンの添加は、アミノ酸代謝経路を阻害し、19.2%のアスタキサンチン産生を増加させることができます;メラトニンの添加は脂質代謝を促進し、アスタキサンチンの生成を30.3%増加させる。

代謝フラックス解析により、ru yiら[41]は、エタノールがrhodaffia酵母の代謝におけるピルビン酸およびアセチル補酵素aの含有量を増加させ、それによってアスタキサンチン合成経路へのフラックス量を2.3倍に増加させ、それによってアスタキサンチン合成を促進することを発見した。同时に、αの代谢量が上がるノードアスタキサンチン合成経路-ketoglutaric酸と5-phosphoribosyl酸のを人を取り締まる。それは、発見さ0.5 g / Lα-ketoglutaric酸を培地が増えるかもしれ酵母赤色ファイフ酵母の成長0.4ことによって、セルg / Lを有する。培地に3 g/ lのグルタミン酸を添加すると、対照群の1.7倍である67.9 mg/ lのアスタキサンチンの生成量が増加した。

酵母は代謝能力が高く、単糖、二糖、多糖、有機酸などの低分子だけでなく、単純な窒素源や複雑な有機混合物も利用できることが知られています。産業廃棄物からの安価な基質を使用することで、バガスやスイートソルガムバガス(ssb)などのアスタキサンチン製造コストを効果的に削減することができます。zhuang yuanら[38]は、室温でのレッドファイフ酵母株およびuv変異誘発に関する研究を行った。育種後に得られた変異株をサトウキビのバガス加水分解液中で22°c、220 r/minで96時間発酵させたところ、カロテノイド濃度は88.57 mg/ lに達した。超音波とセルラーゼを用いて細胞壁をさらに破壊した後、アスタキサンチンの収率は96.01%に達した。stoklosaら[39]は、炭素源としてスイートソルガムのバガスを使用したrhodaff酵母を培養してアスタキサンチンを作る。しかし、フェノール化合物がSSBRhodaff酵母抑制し、抑圧によるSSBが緩和されたによる赤いごはん酵母SSBを重く扱う活性炭とlaccase、それでセル乾燥細菌はついにの重23.6センチに原稿gに15.6%からg / L/ L,アスタキサンチン制作は955 0.0469 mg / Lから占める48.9% mg / Lを有する。

合成生物学において、ターゲット生成物の含有量を増加させる最も一般的な方法は、依然として突然変異と代謝工学によるものである。gassel etal.[40]の系統が得られたアスタキサンチン含有量の高い赤色酵母放射線突然変異を気にしませんその上で、リコピンシクラーゼ遺伝子crtybと合成遺伝子asyを発現させることで、アスタキサンチン合成のフラックスをさらに増加させた。最後に、発酵タンクの増幅実験を行いました最大アスタキサンチン含有量は9.7 mg/g dcwに達した。別の研究では、エルゴステロール合成経路がフィードバックしてmva経路を阻害することが示されている。したがって、エルゴステロール合成に関与する遺伝子を削除することは、テルペンの生産を改善するための有効な戦略である。黄本ら[43]は、エルゴステロール生合成に関与するc-22ステロル・デサチュラーゼをコードする2つのcyp61遺伝子を順次削除し、発酵により検証した組換え赤酵母rhodotorulのglutinisのアスタキサンチン生産1.4倍に増加しました

赤色酵母は、アスタキサンチンを天然に生産するシャーシ細胞の一つですが、野生型の赤色酵母は収量が低く分解しやすいため、大規模な工業生産には課題があります。したがって、現在の研究の第一の目標は、アスタキサンチン高収量株の選択である。将来的には、高収量株を選択するための変異原法、代謝工学、培地組成や発酵条件の最適化などにより、アスタキサンチンの更なる収量増加が期待されます。

Saccharomyces属cerevisiae2.2.2

saccharomyces cerevisiaeは全ゲノム塩基配列解読を行った最初の真核生物である。遺伝子操作が容易で、遺伝子発現制御のメカニズムが明確で、成熟した高密度発酵技術を有しています。特に、近年、saccharomyces cerevisiaeにおける経路の組み立てに適した一連のツールの開発は、合成生物学研究のための理想的なシャーシ細胞を作りました[44]。しかし、多くの人工酵母と同様に、野生型saccharomyces cerevisiaeはアスタキサンチンを合成できない。アスタキサンチン合成を達成するためには、アスタキサンチン合成の鍵となる遺伝子を導入して遺伝子操作する必要があります。合成されたアスタキサンチンの大部分は(3 s, 3&)である#39; S)設定です表2は、saccharomyces cerevisiaeによるアスタキサンチン生産の最新の進捗状況を示す。

異なる種のcrtzおよびcrtwは、saccharomyces cerevisiaeによるアスタキサンチンの合成に重要な影響を及ぼすため、外生のアスタキサンチン合成遺伝子とシャーシ細胞との適合性が特に重要である。wang ruizhaoら[45]は、saccharomyces cerevisiaeにおいて異なる種のcrtzとcrtwを組み合わせて発現させ、30の組み合わせからbrevundimonとしてvesicularisのcrtwとalcaligenesのcrtzを選択し、その結果得られた人工菌株sybe-sc118076までを生産した81.0 0.0469 mg / Lアスタキサンチン。また、重要な遺伝子の変異体をスクリーニングすることで、アスタキサンチンの生産量を増加させる効果的な方法もあります。

例えば、融合酵素の構築は、中間代謝物の蓄積を効果的に減らすことができる。リンカーを用いたcrtwとcrtzの融合をベースに、9つの融合変異体を持つアスタキサンチン生産を増やし方向性進化によって得られたものですこれらの優性変異体を組み合わせることで、対照株の3.8倍のアスタキサンチン含有量を持つ高収量のアスタキサンチン酵母l95s +1206 lが得られた[49-50]。

βの効率を高めるために-carotene変換アスタキサンチン、周坪ら:上取得した[46)酵母ミュータントを通じてcrtZcrtWの共進化監督と同時に導入Gal4M9-based temperature-responsive規制制度(51)これにより細胞増殖結合からアスタキサンチン合成を分離しすなわち30°C気温はょうおんが保たれている第1段階で快速細胞成長を認める細胞がlog期に入ると培養温度を24°cに変更し、アスタキサンチンの合成を促進させた。最後に、235 mg/ lのアスタキサンチンを合成した二相高密度発酵。

アスタキサンチンは脂溶性であるため、これはsaccharomyces cerevisiaeのようなモデル微生物の限られた脂質貯蔵容量と矛盾する[52]。したがって、脂質合成を促進して脂質液滴を拡大し、アスタキサンチン合成のためのより多くの貯蔵スペースを提供することで、アスタキサンチン含有量を増加させることができる。そこでli mingらは、3つの機能を持つcrisprシステムを用いて脂質代謝に関連する遺伝子のライブラリーをスクリーニングし[47,53]、脂質合成を促進するためにopi3とhrd1の発現レベルを適度に上昇させた。crtzとcrtwの発現バランスを調整した後、アスタキサンチン含有量は10.21 mg/g dcwに増加した。最後に脂質合成の空間的制御と温度応答の時間的制御を組み合わせることで446.4 mg/ lのアスタキサンチンが合成された発酵させます

2.2.3 Lipolytic酵母

脂肪分解酵母は最も広く研究され、使用されている非在来型酵母の1つである。脂肪分解酵母によって生産されるアスタキサンチンは、主に(3 s, 3&)に含まれる#39; S)設定です従来の酵母saccharomyces cerevisiaeと比較して、多種類のユニークな生化学的・代謝的特徴を有する。これは典型的なタイプii酵母で、細胞に有毒なエタノールを基本的に産生しない好気性細菌です[54]。また、細胞内には効率的なアセチル補酵素a代謝経路と高いトリカルボン酸サイクル流束があり、脂質の蓄積は77%に達する。これは、有機酸、脂質およびそれらの誘導体の工業生産に理想的です[55-57]。さらに、y . lipolyticaは、より低いphと高い浸透圧で成長することができ、糖、炭化水素、アルコール、脂質などのような様々な炭素源、タンパク質、疎水性基質を利用することができます。このため、成長環境が厳しくなく、さまざまな環境条件で成長することができ、産業応用の見通しも良好である[58]。表3はアスタキサンチン生産の最新の進歩y . lipolytica.によって

のアスタキサンチンbiosynthetic遺伝子様々な情報源から、依然としてy . lipolyticaでのアスタキサンチンの生産に影響を与える重要な要因があります。Kildegaardら表わした[59]からcrtWParacoccusspだけど、N81106にからcrtZp ananatisでハイリスク・ハイリターンβ-carotene-生産y lipolytica离で最適化されのコピー番号、必要な関係の遺伝子コピーを最適化されたミッドレンジと3.5 mg / g DCW(、mg / L)アスタキサンチンが得られた。別の研究では、異なる由来のcrtwとcrtzの3組が発現しており、hpcrtwとhaematococcus pluvialisのhpcrtzが変換活性が最も高いことが指摘されているβ-caroteneアスタキサンチン[65]。riad-riddショートペプチド[62]を用いて関連遺伝子をモジュール化し、同時にコピー数を20に増やすことにより、補充を加えたバッチ培養条件下での組換えリパーゼ酵母の生産量は3.3 g/ lに達したアスタキサンチンは微生物中で最も高いレベルで合成されますシャシーはいまだに確定していない。

微生物の高付加価値化学物質を生産するためのほとんどの代謝調節法は、反応容器として細胞質を使用します[66]。しかし、酵素や基質の分離や代謝クロストークは、細胞質での標的化合物の効果的な合成を妨げることが多い。真核細胞の細胞小器官の領域化は、このボトルネックの解決策となる。例えば、馬英碩ら。[60]だけでなくβの変換を速め-caroteneアスタキサンチンにも格段に小さくなりカロテノイドintermediatesを積み重ねていくということに場所アスタキサンチン合成経路endoplasmicレチクルperoxisomes、をアスタキサンチンの生産量を141倍に増やす。fed-batch発酵では、858 mg/ lのアスタキサンチンが合成できる。

アスタキサンチンは脂溶性のテルペン化合物であり、その疎水性が強いため生物学的利用能が低い。外部油相を添加することで、アスタキサンチンの溶解を促進し、結晶の生成を防ぎ、それによってアスタキサンチンの収率を増加させることができる。yuzbashevaらは、モジュール工学的手法と融合技術を用いて、587.3 mg/ lのアスタキサンチン生産量を有するリパセ欠乏遺伝子組換えsaccharomyces cerevisiae株を構築し、オイル層を加えることで973.4 mg/ lまでアスタキサンチン生産量を増加させることができた。

グリコシル化はまた、著しく増加させることができるアスタキサンチンの水溶性これにより生物学的利用能、光安定性、生物活性が向上する[67-68]。チンギョンら[63]植物性を建立astaxanthin-producing株カロテノイド4-hydroxyを-β-cyclodehydro-genase (HBFD)とカロテノイド-β-cyclodehydro-genaseから(CBFD)の遗伝子夏マリーゴールドPichia pastoris、アスタキサンチン346 0.0469 mg / Lの受益率。その上で、pantoea ananatis (p . ananatis atcc 19321)のゼアキサンチン糖転移酵素(crtx)遺伝子を発現させることにより、糖鎖付加アスタキサンチン合成経路を構築することに成功し、これまで報告されている微生物による糖鎖付加アスタキサンチン生産量の中で最高となる1.47 mg/ lの収率を達成した。

2.2.4 Kluyveromycesmarxianus

近年、kluyveromyces marxianusは天然物の合成に広く用いられている。他の伝統的な酵母と比較して、以下の利点があります。maxicruve酵母は、過剰な炭素源を提供することによって、細胞の生産を増加させることができます[69];maxicruve酵母の中には、高温に強く、25 ~ 52°cで発酵するものもある[70]。適切な糖鎖修飾と強いシグナルペプチドを持ち、saccharomyces cerevisiaeよりも高い分泌能力を持つ[71]。

現在、代謝工学的手法に基づき、マキシクルブ酵母をシャーシ細胞として用いてアスタキサンチンを合成しているが、合成されるアスタキサンチンの多くは(3 s, 3&)である#39; S)設定ですたとえば、lでyujuらは、maxicruve酵母にアスタキサンチンの異種合成経路を構築し、グルコースを用いたアスタキサンチン合成を達成した。そして、haematococcus pluvialisのhpchyb遺伝子とbkt遺伝子をsaccharomyces cerevisiaeのゲノムに組み込み、そのコピー数を増やして4つの修飾菌株を得た。さらに収量を向上させるために、hpchyb遺伝子に部位特異的変異を導入して酵素効率を改善し、ユビキチンによる異種タンパク質の分解を防止した。

これは結局、結果を合成するのに9972μg / g DCWアスタキサンチン5 L fermenter。別の研究では、xylose-inducible promoterと温度調節システムを使用することで、細胞の成長と生成物の合成をデカップリングすることができた。代謝経路および発酵条件をさらに最適化した結果、アスタキサンチンの生成量は56.8 mg/ lであった[73]。アスタキサンチン製造のためのシャーシ細胞としてのマキシクルビン酵母の使用に関する報告はほとんどありませんが、そのユニークな利点は、新しい技術的選択肢を提供します微生物発酵とアスタキサンチンの合成.

2.2.5他の酵母

上記の代表的な遺伝子組み換え酵母以外にも、rhodotorula mucilaginosaや海洋red yeastなどの酵母によるアスタキサンチンの生産に関する報告は比較的少ない。Rhodotorula mucilaginosa入りの赤い酵母石油・は主に用いられるに生産をβ-carotene。でチームを得astaxanthin-producingの変種ウィルスRhodotorula mucilaginosa RG-31変異原を通じて試写そして最適化の発酵アスタキサンチンを成し遂げることが条件内容は126.6μg / mL海紅酵母は、海に自然に存在する単細胞酵母の一種です。耐塩性に優れ、カロテノイド、主にアスタキサンチンを産生する。紫外線変異原法によりカロテノイド生産性の高い海洋濃赤色酵母s8株を得て、発酵条件を最適化することでst5株を得たアスタキサンチンコンテンツから届く520μg / g.

2.3細菌

ため細菌によるアスタキサンチンの低産生アスタキサンチンの研究は国内外の藻類や菌類を中心に行われており、細菌による合成の研究は比較的少ない。ほとんどの細菌のアスタキサンチン含有量は、一部の藻類や菌類に比べてはるかに低いが[20]、細菌にアスタキサンチン合成に関連する遺伝子を導入すると、アスタキサンチンの生産が大幅に増加する。また、菌類や藻類に比べ、細菌発酵を利用することで抽出が容易になり、その後の抽出工程が大幅に簡素化される。特にグラム陰性菌は細胞壁が薄く壊れやすいため、細胞からのアスタキサンチンの抽出が容易である。そのため、細菌発酵によるアスタキサンチンの生産は、アスタキサンチンの生産コストを大幅に下げることができ、今後の工業生産に大きな意味を持つ。

大腸菌2.3.1

大腸菌(escherichia coli)はグラム陰性の嫌気性細菌である。栽培が容易で、操作が簡単で、安価で、成熟した分子遺伝学的修飾ツールを備えています。これは、代謝工学と合成生物学のための最良のホストの一つとなっています。非カロテノイド産生株として、mep経路を介してテルペン化合物前駆体ippおよびdmappを合成することができる。野生型の大腸菌では、ippとdmappを濃縮してgppとfppを生成できるが、fppを最終的なアスタキサンチンに変換する酵素は存在しない。そこで、外来性のアスタキサンチン合成モジュールを大腸菌に導入することで、比較的容易にアスタキサンチンを大腸菌内で合成することができます合成されたアスタキサンチンの大部分はlevorotatoryである(3 s、3' S)設定です表4に大腸菌のアスタキサンチン生産の最新の推移を示す。

アスタキサンチンの代謝合成経路における重要な遺伝子が同定されたことで、高いアスタキサンチン産生を有する人工細菌を構築することが可能となった。[75]koocuria gwangallensisからのmep経路を用いてdxs、ispc、ispd、ispe、ispf、ispg、isphおよびidiを共発現させ、アスタキサンチン合成の変換に関与する遺伝子(crti、crte、crtyb、crtw、crtz)を大腸菌で共発現させてアスタキサンチン産生を増加させた。この人工非メバロン酸経路の遺伝子(dna)が入っていた大腸菌が合成1100μg / g DCWのアスタキサンチン。イソプレノイド経路のlytb、ispa、idi遺伝子はipp、dmapp、fppの合成に必須である。しかし、大腸菌自身はこれらの前駆体を自身の成長ニーズを満たすためにしか合成できず、アスタキサンチン合成経路に向かわせることができないため、アスタキサンチンの収率は低すぎる。このため、李ら過剰発現したとき[76]lytB、ispAアスタキサンチン合成機を積載していな大腸菌内に合成され遺伝子(crtI、crtE、crtYB、crtWcrtZ)、そして最終的に大腸菌人工合成1200μg / g DCWアスタキサンチン。異なるソースからのcrtwおよびcrtzのスクリーニングは、アスタキサンチン生産を改善するためのルーチンの方法の1つである。

たとえば、luら[78]は、異なるソースからのcrtwとcrtzを比較し、brevundimonas sp. sd212からのcrtwとpantoea agglomeransからのcrtzがアスタキサンチン生産に最適な組み合わせであると結論付けた。crtwとcrtzの発現活性のバランスをとることで、プラスミドや抗生物質マーカーを持たない大腸菌asta-1株を作製した。誘導剤を添加しなかった場合、組換え株はカロテノイドの96.6%をアスタキサンチンとして合成し、7.4 mg/gのdcwに達した。wu yuanqingら[79]は、9つのcrtzおよびcrtwを異なるソースからスクリーニングし、それらを遺伝子操作された大腸菌に導入した高いβ-carotene生産また、アスタキサンチン含有量は0.49 ~ 8.07 mg/ lに達した。その後、最適化されたペプチドリンカーを用いてcrtzとcrtwを融合させ、さらにアスタキサンチンの生産量を127.6%増加させた。

li shunら[80]は、gadeプロモーターを選択することによって、大腸菌でhaematococcus pluvialisのhpchy遺伝子と、chlamydomonas reinhardtiiのcrbkt遺伝子を発現させた。最終的に、24.16 mg/ lのアスタキサンチンを合成することができました。これは、その選択を示していますアスタキサンチン合成のための適切な遺伝子要素有意にアスタキサンチンの発現レベルに影響を与えることができます。

キー遺伝子のコピー数を増やすことは、簡単で直接的で効果的なアスタキサンチン産生を増やす方法です。例えば、大腸菌では、crtybのコピー数を増やすことで、不十分なアスタキサンチン蓄積のボトルネックを解消し、プロモーターの発現を調節することで、fed-batch発酵条件下での最終的なアスタキサンチン生産量は1.18 g/ lに達した[20]。

李廸ら[82]初演ランダム変異する行事crtW化從而提β-caroteneアスタキサンチンにそしてコピーcrtW増えCre-loxP製法にcrtZ大腸菌の兵営地とする目的で城郭建造とアスタキサンチン生産高と…最終的に、fed-batch発酵により、アスタキサンチンの生産量は0.88 g/ lに達した[84]。zhang mengら[83]は、paracoccus sp. pc1由来のcrtzとpantoea agglomerans由来のcrtzの共発現がアスタキサンチンおよび中間体の蓄積を増加させることを見出した。最後に、遺伝子組換え大腸菌株pacrtz 2本とpccrtz 1本を持つ遺伝子組換え大腸菌株を作製した。fed-batch発酵70時間後、アスタキサンチンの生産量は1.82 g/ lに達した。

さらに、aを強化するための戦略staxanthin代謝経路独創的な技術でアスタキサンチンの生産量を増やすという目標も達成できる。例えば、パートナーco-expressing遺伝子によってApcpnAアスタキサンチン合成遺伝子を表現ApcpnB大腸菌内に合成され(crtI、crtE、crtYB、crtW crtZ)、产できる最終遺伝子組み換え細菌890μg / g DCWのアスタキサンチン[74]。Lemuthら[77]国産第1 plasmid-free? ?大肠菌と融合安定的なアスタキサンチン生の遺伝子(dna)経路を通じて大腸菌染色体にγ歩道組み換え技術だけでその経路アスタキサンチン合成を指さした。最終的なアスタキサンチン含有量は1.4 mg/gのdcwに達した[85]。形態学に基づく酸化ストレス工学は、大腸菌におけるアスタキサンチン合成を改善するための効果的な戦略でもある。例えば、形態や膜に関連する遺伝子を削除すると、細胞が大きく長くなり、アスタキサンチンの蓄積が増加する。

酸化ストレスとは、細胞内で活性酸素と抗酸化物質の産生が不均衡になり、細胞を損傷させることです。したがって、酸化ストレスに関連する遺伝子を削除することで、細胞内の活性酸素の量を増やし、細胞を保護することができます[81]。また、温度上昇後も細胞形態は変化し、活性酸素の濃度も高くなります。したがって、温度感受性プラスミドの相補的な発現系を確立することにより、この大腸菌株のアスタキサンチン含有量を最終的に11.92 mg/g dcwまで増加させることができます。さらに、酵素の局在戦略を用いて、遺伝子操作された大腸菌におけるアスタキサンチンの生産量を増加させることもできる。例えば、叶丽君ら。【86-88】昔の言葉にあわせてβれることが現地化大腸菌タグ-caroteneだろdioxygenase異なるセルにPhCCD1た結果、触媒効率はレストボックス最適な膜。crtwとcrtzをglpfタンパク質を介して大腸菌の細胞膜に融合させた後アスタキサンチンの生産は215.4%増加しました.

2.3.2 Paracoccus

パラコクス(paracoccus sp.)は、アスタキサンチンやその他の希少カロテノイドを細胞内に含む好気性グラム陰性細菌である。しかし、パラコクスにおけるアスタキサンチン合成に関する研究論文はほとんどない[89-90]。天然のカロテノイドは通常、ヒトや動物の生物学的利用可能性が低いe配置に存在する。「z異性化」は、それらの生物学的利用能を高める有効な手段である[91-93]。例えば、hondaら[94]は、このようなカロテノイドを異性化するためのシャシーセルとしてcoccolithophoreを使用しました亜臨界水条件下でのアスタキサンチン(水を沸点以上、臨界点以下に加熱し、系の圧力を制御して水を液体状態に保つ)。加熱・加圧条件下でエタノールを添加すると、「z異性化」の効率が大幅に向上することがわかりました。加圧条件下では、「z異性化」の効率が大幅に向上した。最終的に、30分間の亜臨界水処理の結果、カロテノイド分解を抑制しながら、z異性化比50%以上のアスタキサンチンが得られました。

発酵中の培地組成やパラメータを適切に調整することは、アスタキサンチンの生産量を増やすための有効な方法です。トリカルボン酸中間体を培地に添加すると、前駆体の供給が促進される。酵素の活性は補因子を加えることによっても増強されるアスタキサンチン合成における主要な酵素(硫酸鉄、アスコルビン酸、nadph、atp、2-オキソグルタル酸)、それによってアスタキサンチンの蓄積を増加させる。例えば、は芽胞てアスタキサンチンを輩出したシャシーに活動Crt酵素を増やし5 mmol / Lリンゴ酸を加え、加水分解mmol 1 / L硫酸第一鉄、アスタキサンチン増産177μg / Lから3750μg / L [95]は細菌によるアスタキサンチンの生産それ自体は藻類や酵母によるものよりも低く、それはその後のエンジニアリングされた株の構築および改変のための代替遺伝子要素を提供します。

別の細菌2.3.3

アスタキサンチンを産生する細菌は比較的少なく、収量も比較的低い。最も研究されているのは、シャーシ細胞としての大腸菌である。また、乳酸菌(mycobacterium lacticola)やベビバクテリウム属(bevibacterium)もアスタキサンチンを産生する。しかし、mycobacterium lacticolaは炭化水素培地上でのみアスタキサンチンを生成し、栄養素培地上では生成しません。ベビバクテリウム属は油中で生育し、発酵終了時のバイオマスはわずか3 g/ lで、アスタキサンチン含有量はさらに低くなります。

要約すると、大腸菌は現在、細菌の間でのアスタキサンチン生産にとって理想的なシャーシ細胞である。

3 .アスタキサンチンの抽出工程

アスタキサンチンは細胞内生成物である微生物からのアスタキサンチンの抽出は、細胞破壊と収集の2段階に分けられる。細菌に比べて、藻類や酵母の細胞壁は硬くて厚く、壊れにくいため、製品の抽出が難しい。そのため、アスタキサンチン抽出の焦点は細胞壁破壊である[96]。

細胞壁を破壊する従来の方法には、主に物理的、化学的、および酵素的な方法があります[97]。物理的方法には、機械破砕、超音波破砕、超臨界流体抽出などがあります。機械破砕は操作が簡単で、細胞壁を機械的な攪拌によって引き裂き、細胞内にアスタキサンチンを放出する。しかし、機械破砕は場所によっては高温を引き起こし、ある程度アスタキサンチンを損傷させる可能性があります。超音波破砕は溶質内の細胞壁を効果的に破壊することができるが、超音波作用の強度と持続時間が増加するにつれて、高度に酸化性のフリーラジカルの生成が増加し、減少するアスタキサンチンの抽出速度。超臨界流体抽出法は、様々な藻類製品を抽出するために近年最も有効な抽出法である。従来の液体溶剤と比較して、高い拡散率、高い圧縮率、低い表面張力、低粘度、細胞壁の容易な浸透などのいくつかのユニークな物理的および化学的性質を有し、製品の抽出効率を向上させる。

化学的手法としては、主に有機溶媒抽出法、酸塩基処理法、ジメチルスルホキシド(dmso)法などがある。アスタキサンチンは脂溶性の天然物であるため、有機溶媒の選択は考慮しなければならないアスタキサンチンは水溶性溶媒の極性を示します例えば、xing taoら[99]は、haematococcus pluvialisからアスタキサンチンを抽出するために酢酸エチルを有機溶媒として使用し、最終収率は98.51%であった。有機溶媒を使用してアスタキサンチンを抽出することは収率が高いが、多くの溶媒が毒性を持ち、アスタキサンチンに有害な影響を与える可能性があるという欠点がある。酸塩基処理では、酸やアルカリの試薬を大量に使用するため、アスタキサンチンを損傷させるだけでなく、環境汚染を引き起こす可能性があります。ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)は、水や有機溶媒に可溶な極性溶媒である。これは、アスタキサンチンに大きな影響を与えることなく、細菌の細胞壁を迅速かつ効率的に破壊できるため、実験室で細胞壁を破壊するために一般的に使用される溶媒である[100]。アセトンと適切な割合で混合すると、比較的完全にアスタキサンチンを抽出することもできます[101]。

アスタキサンチンの酵素抽出温和な条件、低エネルギー消費、短い処理時間の利点があります。迅速かつ効率的に細胞壁を破壊し、細胞からアスタキサンチンを放出するだけでなく、細胞の活性を阻害して細胞内物質の変性を防ぐ[102]。そのため、酵素法で抽出されたアスタキサンチンは、他の方法で抽出されたアスタキサンチンよりも安定である。例えば、β-glucanaseできるhydrolyzeβ-glucan細胞壁では、アスタキサンチンが細菌からこぼれるのを防ぎ、損失を減らすことができます[100]。しかし、この酵素法は多量の酵素を必要とし、生産コストが上昇することは間違いありません。一方、酵素は本来タンパク質であるため変性しやすく、大規模なアスタキサンチン抽出には適していません。

からアスタキサンチンは強い抗酸化物質である空気に長時間さらされると、空気中の酸素がアスタキサンチンと反応して抗酸化力を失う。したがって、無酸素(窒素を充填した)抽出プロセスも、現在の工業生産では利用できないステップの1つです。この方法では、不活性ガスまたは窒素を充填することで無酸素環境で有機溶媒を抽出することができ、その活性を保護し、アスタキサンチンの抗酸化活性を大幅に向上させることができます。

4まとめと展望

♪広いから♪食品分野でのアスタキサンチンの応用アスタキサンチンは、医薬品や化粧品などの市場で需要が増加すると予想されています。現在、アスタキサンチンの主な生産方法は化学合成だが、化学合成には限界があるため、世界各国での化学合成管理が厳しくなっている。しかし、天然資源から直接抽出されるアスタキサンチンは、消費者の需要を満たすことが難しい。

したがって、微生物発酵によるアスタキサンチンの工業生産は有望な選択肢である。酵母は、基質スペクトルが広いこと、培養が容易であること、発酵サイクルが短いこと、遺伝子改変ツールが比較的成熟していることなどの利点から、最も有望なシャーシ細胞である。その中で、rhodopseudomonas palustrisが可能です自然生産アスタキサンチン成長が早く様々な炭素源を利用できますヤロウィアlipolyticaは、高アセチル補酵素aフラックスとトリカルボン酸サイクル代謝経路を持って、低いphと高い浸透圧で成長することができます;saccharomyces cerevisiaeは、遺伝子操作が容易で、遺伝子発現を制御するメカニズムが明確で、成熟した高密度発酵技術を持っている。ピヒア・パストリスは高温に耐えることができ、適切なグリコシル化が行われ、強力なシグナル・ペプチドを持つ。

合成生物学、タンパク質工学、代謝工学、発酵工学の急速な発展に伴い、多くの微生物がシャシー細胞として使用され、アスタキサンチンが生産されている。しかし、重要なにもかかわらずアスタキサンチン生合成のブレークスルー挑戦ているが、

第一に、アスタキサンチンを自然に生産できるrhodotorula glutinisやhaematococcus pluvialisなどの微生物は、生産量が少なく、培養条件が厳しく、コストが高いという問題点がある。この問題を解決するためには、今後、高収量株の栽培とスクリーニング、および収量増加とコスト削減のための培養条件の最適化に注力する必要があります。

第二に、複雑な同化作用のためアスタキサンチン合成の経路大腸菌、lipomyces starkeyi、saccharomyces cerevisiaeなどのモデル生物の代謝工学における収率が低いなどの問題が残っています。そのため、シャーシ細胞でのアスタキサンチン合成効率を向上させるためには、以下のような方法が考えられます(図4)。例えば、切断されたthmg (n末端で500アミノ酸で切断されたもの)は、mva経路の重要な遺伝子であることが示されている。それは効果的にそれ自身の分解を防ぐことができ、それによってカロテノイドの生産を増加させる。

(2) 異なる強度のプロモーターを置換することで、代謝経路における触媒マッチングが改善される。例えば、βの遺伝子も-carotene生、力強いポーズ代わり発起人PTEF他無力な発起人に名を大きく低下させβ-carotene生産ヤロウィアlipolyticaで[103]。

③上げるため遺伝子コピー番号の暗号鍵を増やしrate-limiting界代謝磁束は階段を上がった。例えば、コピーcrtYB数から1 ~ 4人に増えたが、β-carotene[104]増産された76%カットする。

④モジュール組立鍵遺伝子と異なる枡を用いるリンカーその他短いペプチドている炭素代謝を改善流動的です不安アスタキサンチンのを高めた。

全ての細胞内小器官は、それぞれの細胞内に局在しているアスタキサンチンの保管スペース。カロテノイドは一般的に細胞膜に貯蔵され、細胞膜の流動性を低下させ、細胞死を引き起こす可能性がある。細胞内小器官におけるカロテノイドの代謝経路のローカライズは、代謝障害を減らすことができます代謝障害。同時に、それはまた、細胞内のカロテノイドの貯蔵空間を拡張することができ、細胞への毒性を減少させる。例えば、真核細胞の小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシソームは、カロテノイドの合成に有利な条件を提供する独特の物理的環境を持っている。

⑥発酵と条件最適化は、最も一般的な増産を誘導する最も効果的な手段アスタキサンチンです例えば、異なる炭素源と窒素源、異なる炭素比と窒素比、ph値、温度制御を使用して用土を最適化します。

それにもかかわらず、それは注目に値する生合成によって生成されるアスタキサンチンの方がはるかに用途が大きい化学合成によって生成された値よりも、その適用はまだ多くの国の法律や規制によって制限されています。例えば、米国fdaは、アスタキサンチンを加熱すると発癌性物質が発生する可能性があるため、食品添加物として使用することを禁止している。フランスは、アスタキサンチンは特定の健康製品と化粧品にのみ使用できると明示している。そのため、微生物発酵によるアスタキサンチンの生産にはまだ長い道のりがあります。

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