d allulose粉の生産方法はどれらがありますか?

1 D-Allulose概要

dアルロース(d allulose)は、ヘキソース糖であり、d-フルクトースのc-3エピマーである。d-アロロースは、その高い甘味、低エネルギー、独自の生理機能、健康効果などから、大きな可能性を秘めた新しい甘味料と考えられています。希少糖生合成の分野で世界的に注目されています。しかし、d-アルロースは極めて希少であり、化学的に合成することは困難である。一方、生合成法は簡便であり、近年大きな進歩を遂げている。だから、笔者の主张?レビュー最近の研究生で特段の進展D-allulose、physicochemical特性を含む生理機能アプリケーション、in vivo代謝に対し、D-alluloseの酵素生产、消息筋を覆うと、酵素文化財クリスタル構造、メカニズム触媒についてheterologous表情、分離と浄化プロセスに係る鍵酵素。

1。1 d-アルロースの物理化学的性質と起源

d-アルロース(d- allulose)は、6炭素の糖である融点は96°cで、水に溶け、密度は1.35 g/cm3である[1]。d-アルロースの甘さはスクロースの70%である[2]。d-アルロースは還元糖であり、熱処理中に褐変反応に関与する。ラット実験では、d- alluloseの発熱量は0.029 kj /gであり、これはスクロースのエネルギーの0.3%であり、d- alluloseのエネルギーはほぼゼロである[3-4]。d- alluloseは、自然界では非常にまれであり、植物源は非常にまれです[5]。一部の細菌でも少量のアリュロースが見つかっており[6]、d-アリュロースは動物には見られない。動物では発見されていない。しかし、長期間の加熱処理を経た果汁など、さまざまな食品にもd- alluloseが含まれており、各食品中のd- alluloseの含有量は、製造過程における糖度や温度、加熱時間と密接に関係している[2,7]。

1.2体内におけるd- alluloseの生理機能と代謝

のD-alluloseの生理的機能含まれています:食事のd-フルクトースとd-グルコースの吸収を減少させる[8-9];インスリン抵抗性を高める[7,10-11];肥満活動[14];血中脂質を低下させます[15]。1)腸内でのd-アルロースの輸送はグルコース輸送体によって媒介され5、d-フルクトースに対する親和性が低い[16-18];2) d-アルロースはグルコース関連代謝には関与していない[19];3) d-アルロースは動物の肝臓では代謝されないため、肝臓のエネルギー産生を促進することはできない[20]。d- alluloseの約98%は、経口投与または静脈投与後に尿や糞の形で体内から排泄され、わずかなd- alluloseが盲腸内の微生物の作用によって短鎖脂肪酸に分解される[21]。

1.3 d- alluloseの応用

d-アルロースはgrとして(generally regarded としてsafe)製品として承認された2011年に米国fdaによって食品成分および栄養補助食品として許可されています[4,7]。研究によると、d-アルロースの最大摂取量は1日あたり体重1 kgあたり0.55 gであり、この範囲内ではヒトに下痢を引き起こさないことが示されています[8-9]。

d-alluloseは、食品業界において大きな市場性を有していますその低カロリー含有量、高い甘味と強い還元特性のために。例えば、d-アロロースは、メイラード反応により、ゲル強度、乳化安定性、発泡性、抗酸化活性など、卵白タンパク質の特性を総合的に向上させることができる[22-23]。d-アルロースはまた、発酵牛乳の品質を向上させ、過剰発酵によるヨーグルトの強い酸味を調節することができるが、発酵菌株のプロバイオティクス活性や発酵製品に与えるプロバイオティクスの健康効果には影響しない[21]。さらに、ベーキングに25%のd- alluloseを使用すると、他の添加物と組み合わせることで、無糖のケーキを作ることができます[24]。

他の分野での応用も期待されています。例えば、d-alluloseから作られた植物性材料は、光デバイスや液晶ディスプレイのための永久的、防水的、環境に優しい透過膜として使用することができます[25]。d- alluloseは、初めて発見された糖系の虫除け剤でもあり、寄生虫の増殖を抑制する効果がある[26-27]。d- alluloseは他のヘキソースの前駆体でもあり、d-アロースの生成に非常に重要な役割を果たし[28-29]、d-アリトール[30]は非常に重要な役割を果たしている。

2.生物酵素方法

の化学合成法d . alluloseには克服が難しい共通の欠点がある分離の困難さ、多くの副産物、化学廃棄物の発生などです。そのため、エコで環境にやさしい生物酵素の製造法が世界的に注目されています。

2.1.1 dteaseファミリー酵素の供給源

d-tagatose 3-epimeraseファミリー(dteases)は、ケト単糖のc3位の異性化を触媒する酵素であり、希少糖の生産のためのコア酵素でもある[32]。酵素のdteaseファミリーには以下のものがある。D-tagatose 3-epimerase(dtease)[33]、d-アルロース3-エピメラーゼ(デイース)[35]、ケトース3-エピメラーゼ[36]など、いずれもd-フルクトースからd-アルロースへの変換を触媒する共通の性質を持つ。

dteaseをコードする遺伝子は、clostridium cellulolyticum h10[37]、ruminococcus sp.[38]、clostridium scindens[34]、desmosporのsp.[35]から連続的に分離されていますが、より多くのソースとより効率的なdtease[32, 37, 39-40]を探索する必要がありますd-alluloseの工業生産.

2.1.2 dteaseの酵素特性

dteaseファミリーの中ではd-アルロース-3-エピメラーゼ(dtease)は、d-フルクトースとd-アルロースの反応を最も効率よく触媒する。c . cellulolyticumとの. tumefaciensのdaeasesの触媒効率(kcat / km)はそれぞれ186.4 l /(mmol・min)と205 l /(mmol・min)であり、clostridium sp.のdtease (141.4 l /(mmol・min))と比べて高い ruminococcus sp. (51 l /(mmol・min))[34, 37 - 38]、表1参照。

金属イオンは、d-フルクトースに結合することで固定され、変換に重要な役割を果たしますD-fructoseにD-allulose。asp183とhis209残基は、金属イオンを介して基質と効果的に結合する。dteaseファミリーの酵素は、金属イオンmn2 +、co2 +、mg2 +に対する依存度が著しく異なる[41,44- 45]。しかし、c . cellulolyticumのdaeaseとc . scindensのdteaseの酵素活性は、金属イオンmn2 +とco2 +に厳密に依存しています[35,37]。

2.1.3 dteaseの結晶構造

dteaseファミリーの酵素の中で、の. tumefaciensとc . cellulolyticumのdaeasesは四量体に最も近い。ダイス四量体では、2つのサブユニットのアミノ酸残基間に34個の水素結合が形成される。daeaseの高い触媒活性は、dteaseファミリー酵素の2つの二量体間の広範な相互作用によって引き起こされる広い界面の溶媒にアクセス可能な領域に起因する[42]。また、組み換え株で発現したダイスは、依然として優れた酵素特性を示す。c . cellulolyticum h10からのdaeaseの異種発現は、より長い半減期、より高い運動パラメータおよびより高い熱安定性を有する[37]。

ダイスの四次配置は、4つの同一のサブユニットa、b、c、dからなる不斉単位である。これらの4つのサブユニットは、サブユニットaとサブユニットdが相互作用し、両方ともサブユニットbとcと密接に接触する結晶対称性によって関連する二量体である。これらの安定した二量体は、二量体の前面にある基質を結合するための優れたアクセス可能な表面を提供する[16]。

活性部位の疎水性溝とアクセス可能な表面は、aサブユニットとbサブユニットの間に位置している。daeaseのサブユニット側は閉じられ、バレル構造の両端で露出している。ダイスの四量体では、2つの二量体がバレル構造の両側に囲まれている。各単体(サブユニットA、B、C、D)は8人で構成されている(β/α)構造の単位繰り返されている。各単体はを13α-helices 8β-folds、の主要構成を形成単体で[16]ん。

2.1.4 dteaseの触媒機構

dteaseファミリーの酵素の触媒作用はサブユニットの分子配置に依存する。それらの活性部位は基質上に位置し、効率的な酵素反応を達成する。mn2 +と2つの水分子、4つのアミノ酸(glu、asp、his、glu)は八面体配位を形成し、これら4つのアミノ酸残基は全てのケトース- 3-エピメラーゼで完全に保存されている。の. tumefaciensのdaeaseおよびp . cichoriiのdteaseからの6つの残基(glul50 / glul52、aspl83 / aspl85、his209 / his211、glu244 / glu246、glul56 / glu158、his185 / his188)は、部位特異的変異形成において基質結合と熱安定性に重要である。

基質が水分子を置換した後、活性部位はジアステレオ異性化を受ける。2つの残基、glu50とglu244がmn2 +と協力してプロトンを除去するd-フルクトースのc3はd-アルロースのシジオール中間体を形成するそして、daease活性部位の水素結合と水分子の間の位置からd-アルロースが放出される。

現在、dteaseファミリーの酵素の触媒活性と熱安定性を向上させるための分子修飾が行われている。d- alluloseの生成において、カルジセルシロルプトル黒点症からのl-ラムノーズイソメラーゼの熱安定性と触媒的挙動を改善するために、部位特異的変異導入法が用いられた。疎水性の残留でし、第1βα1-loop極地アミノ酸を完全に置き換え。v48n / g5 9 n / i63n変異体とv48n / g59n / i63n / f335s変異体は、野生型酵素と比較して、それぞれ105.6%と134.1%高い活性を示しました[57]。また、ミュータントモードも追加されたdorea sp.のd-アルロース-3-エピメラーゼ(daease)の熱安定性。[50]。

dteaseファミリー酵素の触媒機構の研究はまだ始まったばかりであり、酵素の構造と触媒機能の関係についてはさらなる研究が必要である。さらに、dteaseの熱安定性と基質特異性にはまだいくつかの欠陥がある。希少糖の生産においては、dteaseファミリー酵素の基質特異性を利用して、機能的な希少糖の効率的かつグリーンな生産を実現する必要があります。

2.1.5 dteaseの異種発現

ほとんどのdteaseファミリー酵素は細菌から同定され単離されており、天然株に発現する酵素の数は用途の要件を満たすにはほど遠い。したがって、発現ベクターを構築し、それらを異種生物で発現させることは、特性解析や酵素応用において非常に重要である。

枯草菌(bacillus subtilis)、大腸菌(escherichia coli)、酵母は、ダイス発現のための組換え系を構築するために一般的に使用されている。枯草菌は、大腸菌のように外膜を持たないため、菌が分泌するタンパク質を培地に直接放出することができます。枯草菌も食品グレードであり、それが分泌するタンパク質には耐熱性のリポ多糖類(エンドトキシン)を分泌しない。遺伝子操作された大腸菌(escherichia coli)は、明確な遺伝的背景、完全なベクター受容体システム、急速な成長、簡単な栽培、および組換え安定性の利点を持っている。また、酵母の発現系は、培養条件が簡単で、増殖速度が速く、発現レベルが高く、操作が簡単という特徴があります。翻訳後、タンパク質は加工され、正しく修飾されます。酵母の発現系の欠点は、クローニング遺伝子の発現が低いこと、発酵時間が長いこと、タンパク質のグリコシル化が正しくないこと、細胞分裂に抵抗性があることである。また、上清中の多糖類の高濃度は、組換えタンパク質の精製には役立たない。

初期の研究者は、dteaseファミリー酵素の発現および酵素学を研究するために、宿主細菌として大腸菌を使用する傾向がありました[34,37]。最近、多くの研究者が枯草菌や酵母を宿主細菌として用いて、d- allulose生成のためのdteaseファミリー酵素を発現させている[35]。a . tumefaciensのdaease遺伝子は、組換え後に大腸菌とk . marxianusで発現し、allulose産生に利用されたd-アルロースの収量は230 g/ lに達した[53]および190 g/ l[56]。一方、大腸菌発現系を用いてa . tumefaciensで発現しているdaease酵素は、表2に示すように、これまでで最も高い発現レベルを示している。

(1) 大腸菌発現系:大腸菌発現系には低コストで高い発現効率があるという利点があります。酵素のdteaseファミリーは、大腸菌において可溶性タンパク質として過剰に発現させることができる。組換えdtease酵素は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて分離精製され、の収率d-アルロースは120 - 218 g/ lである変換率は24 ~ 33%(34)です。組み換え大腸菌でagrobacterium tumefaciensの全細胞応答法を用いて発現したdaease酵素の収量と変換効率は、それぞれ230 g/ lと33%であった[53]。

(2) bacillus発現系:daeaseをコードする遺伝子を持つ枯草菌組換え菌は、daease酵素を高効率かつ低コストで過剰発現させることができます。アニオン交換樹脂マトリックス上に固定化された組み換えダイスは、アリュロースの安定的かつ効率的な生産を促進することができます。枯草菌(bacillus subtilis b . subtilis)で発現する遺伝子組み換えデースは、大腸菌(8.95 u /mg)よりも高い58.6 u /mgの活性を持つ。また、daeaseの発現調節因子も酵素の量と活性に影響を与える。枯草菌(bacillus subtilis b . subtilis)では、ベクターpma5- pxy / a-rdpeが95 u / mlの酵素活性で安定に解毒を発現する。この値は、pbluescript-sk-dteベクターを持つ大腸菌で発現する酵素活性よりも高い[54]。

3)酵母の発現系:

外生のdaease遺伝子は、組換えs . cerevisiae[55]およびkluyveromyces marxianus[56]で高度に発現することができる。a . tumefaciens由来のdaease遺伝子を持つ発現ベクターprs424-tefpr-ss-xy / aは、s . cerevisiae an120において相対分子量33 000のタンパク質を発現することができる[55]。t . thermophilusのxyloseイソメラーゼ遺伝子とa . tumefaciensのdaease遺伝子が酵母胞子で共発現し、相乗的な触媒作用を促進する。2つの組換え酵素が固定化されたとd-アルロースは、d-グルコースを基質として生成された[55)。組換えキシロースイソメラーゼはd-グルコースからd-フルクトースへの変換を触媒し、組換えダイスはd-フルクトースからd-アルコースへの変換を触媒する。yangらは、再生触媒的方法でd-アロロースを生産できる修飾k . marxianus細胞を再生するための貴重な方法を提供した[56]。組み換えk . marxianusは、12時間以内に750 g/ lのd-フルクトースの基質濃度から190 g/ lのd- alluloseを生成し、約100 gのd-フルクトースが34 gのエタノールに変換された。さらに、細胞全体の生物分解によってd- alluloseを生産するというアイデアも提案されている[56]。

2.2 d-アルロースの分離精製

のd-アルロースの分離精製には、主に次の2つの方法がある1つ目はイオン交換樹脂です。アニオン交換樹脂マトリックスと同時移動ベッドクロマトグラフィーを用いてdaease酵素を固定化し、d-フルクトースからd-アルロースを生成させた。イオン交換樹脂透析を用いると、r . sphaeroides sk011細胞は、初期基質濃度50 g/ l d-フルクトース[39]から6.5 g/ l d-アルロースを生産することができ、生産速度は0.82 g・h-1である。d-アルロースとd-フルクトースを混合した系では、まずd-アルロースをグルコン酸に変換し、アニオン交換樹脂で91.2%まで精製した[57]。

2番目の方法はaを使用するd- alluloseを浄化する生物学的方法。d- alluloseとd-フルクトースを混合した系では、酵母を用いて残りのd-フルクトースを消費してエタノールを生産することでd- alluloseが得られた。さらに、浸透圧蒸着法、陽イオン交換クロマトグラフィー、生物学的手法を組み合わせて、d-alluloseを最大86.2%の純度で分離・精製した[58]。

3討論

d-アルロースは、多くの生理機能を持つd-フルクトースのc-3エピマーであり、食品、医学、医療などで広く用いられている。米国fdaは2019年4月に除外するための有利な措置を可決した後添加糖のカウントからのalluloseそして、総糖、大手企業はalluloseに大きな関心を持ち始めています。現在、world&#韓国を含むd- alluloseの39の主要生産者、's cj cheiljedang, のuk ' sテイト&ライルとJapan'の松谷グループは、すべての生物学的方法を使用してd- alluloseを生産する。したがって、d-アロloseの生産を触媒する遺伝子組換え細菌の構築は、d-アロloseの工業化の重要な基盤となる。現在、一部の国では合法的に使用されていますが、将来的には主要な甘味料になることは間違いありません。

d- alluloseの生物酵素法の研究には大きなブレークスルーがあるが、特に遺伝子マイニングと細胞構築技術の急速な発展は、産業の見通しであるd-アルロースの生物学的生産は不明である。後続の研究を行うことができる以下の2の分野1)上映DTEase家酵素活動や安定性の高い遺伝子する採掘手法を通じて確立効率的な高スループットスクリーニングたちを分子構造DTEase家酵素を変形した方がいい、工業化のニーズに応えることがことD-fructoseの有効変換・D-allulose2) d-アルロースの工業的調製は、酵素反応後の混合物中のd-フルクトースの残留除去という課題があるため、d-アルロースを分離精製することで生産コストが上昇する。現在、d-alluloseの分離・精製・結晶化に関する研究は少なく、下流の工業化が遅れていることが示唆されている。分離精製、結晶化、乾燥などの下流工程を簡素化することで、d-alluloseの工業生産コストをさらに削減し、生産効率を向上させる必要がある。

図1は、d-alluloseのためのより高度なグリーンでリサイクル可能なプロセス技術を示しています[16]。反応系全体は、(ショ糖の加水分解のためのバイオリアクターaとの間で分割されます酵素をd- alluloseに変換する)、バイオリアクターb(エタノール製造、d- allulose分離、酵母増殖用)。スクロースの原料としては、生のサトウキビジュースやスイートソルガムジュースが用いられる。使用された操作酵母は、天然のスクロースイソメラーゼと組み換え外因性dteaseファミリー酵素遺伝子を含むため、操作酵母は、スクロースをスクロースイソメラーゼで加水分解することにより、d-グルコースおよびd-フルクトースを生産することができます。d-フルクトースはdteaseファミリーの酵素によって55~60°cでd-アルロースに変換され、残りのd-グルコースとd-フルクトースは27 ~ 30°cで発酵されてエタノールになり、エタノールは回収されて燃料として利用される。この方法の利点は、原材料コストが低いこと、プロセス中に生成される中間生成物をできるだけ使用すること、面倒な分離・精製ステップが削減されること、廃棄物の発生が削減されること、エネルギー消費が少ないこと、砂糖収量が高いことです。

4展望

現在、d-アルロースは中国ではトンレベルで工業的に生産されている、日本、韓国、米国、英国。激しい産業競争の中で頭角をあらわにするためには、dアロロースを生産する企業は、各リンクの技術を向上させなければならない。現在、主な生産障壁は、イソメラーゼの低活性、低変換率、低再利用頻度である。したがって、酵素活性、安定性、触媒効率を向上させることが、dteaseファミリー酵素の将来の研究開発の重要な目標となるはずです。脱色、脱塩、結晶化、乾燥の工程を改善することで、生産コストを低減することができます。効率的なハイスループットスクリーニング技術を使用して不合理なプロセスを合理的に設計または修正することは、酵素のdteaseファミリーの構造を変更する直接的な方法です。酵素のdteaseファミリーを改良し、製造プロセスを改善することにより、d-プシコースの製造コストを低減し、価格を下げることができ、消費者にd-プシコースを容易に供給することができる。

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