4 haematococcus pluvialis astaxanthin検査法

アスタキサンチン3,3' -dihydroxy-beta、beta' -carotene-4、4' -dioneケトカロテノイドに属します研究によると、アスタキサンチンは最強の天然抗酸化物質です[1-2]。アスタキサンチンは、抗酸化、抗放射線、抗老化、抗腫瘍、心血管疾患の予防・治療機能[2-3]を有しており、極めて高い経済的価値を有しています。健康食品、医薬品、飼料添加物、化粧品、機能性食品、食品添加物などの分野で使用されています[4]。

主な原料生産アスタキサンチンエビやカニの殻[3,5]、haematococcus pluvialis[4]、rhodotorula glutinis[6]から得られる。その中で、haematococcus pluvialisはストレス条件下で乾燥重量の5%まで蓄積することができる。アスタキサンチンの構造は2つのキラルなc原子を含むため、haematococcus pluvialisの構造は3 s, 3 s &である#合成形態はキラル混合物で、主に3 r, 3 r &である#39である。haematococcus pluvialisは天然のアスタキサンチン生産の最良の供給源であると考えられている。

haematococcus pluvialisは、ストレス後にゼラチン状の殻のような外壁を形成する。細胞内の色素を抽出する際、従来の溶媒が細胞内部に入り込むことは困難であった。通常、細胞壁を破壊する方法を組み合わせる必要があります。次に、学名はhaematococcus pluvialis細胞は主にアスタキサンチンエステル、すなわちアスタキサンチンモノエステル分子と異なるアシル鎖を持つアスタキサンチンダイエステル分子の形で存在する。hplc分析では、すべての分子のベースライン分離を達成することは困難であり、含量を計算する際に分子量が異なります。

また、アスタキサンチンは不安定であり、光や熱などの条件下で分解しやすいため、正確な測定には問題がありました。本稿では、抽出、加水分解、検出の観点から現在の研究状況を概観する学名はhaematococcus pluvialis,異なる目的のためにhaematococcus pluvialis中のアスタキサンチン含有量の迅速な決定のための適切な方法の選択に関するガイダンスを提供することを視野に。

1 haematococcus pluvialisからのアスタキサンチンの抽出

のアスタキサンチンを抽出するその内容の正確な決定のための基礎であり、また、アスタキサンチン測定の不確かな側面の一つです。ストレス条件下では、haematococcus pluvialis細胞はアスタキサンチンを蓄積するが、細胞の成長と分裂は停止し、動かない胞子、すなわちゼラチン状の細胞を形成する。成熟したゼラチン状細胞は3層の厚さの硬い細胞壁を持ち、最外層は酢酸の加水分解に強いアルゲナンである。第2層と第3層は、それぞれマンノースとセルロースが均一かつ不均一に分布している[7]。

ゼラチン質の細胞壁を持つhaematococcus pluvialisの場合、従来の溶解・抽出法では細胞内部にアクセスして色素を抽出することができません。

現在、産業界では、haematococcus pluvialisからアスタキサンチンを抽出するために、超臨界co2抽出技術[7]、高圧/超高圧均質抽出技術[8]、負圧キャビテーション法[9]が用いられている。この方法は、アスタキサンチンを効率的に抽出することができるが、algalパウダーを大量に必要とし、操作が複雑であるため、大規模工業生産に適している。haematococcus pluvialisからアスタキサンチンを検出するために用いられる抽出法には、溶媒抽出、機械的粉砕+溶媒抽出、ジメチルスルホキシド(dmso)抽出、セルラーゼ壁破壊+溶媒抽出がある。

1.1溶媒抽出法

溶媒抽出法は、操作が容易で低コストであり、設備も少ない。抽出溶媒、液対溶媒比、抽出温度、抽出時間を最適化するだけで済みます。一般的に使用される溶媒は、アセトン[10]、酢酸エチル、ジクロロメタン、エタノールなどです。しかし、haematococcus pluvialisのゼラチン状の殻の外壁のために、従来の溶媒が細胞内に入り込むことができず、アスタキサンチンの抽出率が低い。Mendes-Pintoら紙はアセトンからアスタキサンチン抽出溶媒に使わHaematococcuspluvialis、抽出率はわずか4 mg・てろ助け(アスタキサンチン大量藻は1 gにつき抽出粉)、机械が粉砕+アセトン抽出問題は19% mg・てろ助けを示す抽出する細胞に入れなかっに使う溶媒アスタキサンチン[10]。

ruen-ngam社は、超音波(超音波を用いた抽出)、マイクロ波(マイクロ波を用いた抽出)、soxhlet (soxhletを用いた抽出)による溶媒抽出法を比較した。抽出率は75°cで5分間マイクロ波を用いて74%に達した[11]。加えて、溶媒の抽出効率を高めるために、化学的細胞壁破壊は、pluvialis haematococcus細胞を酸またはアルカリで処理する。saradaらは、細胞を70°cで2 mol・l-1塩酸溶液で2分間処理し、その後溶媒で抽出すると、86% ~ 94%のアスタキサンチン抽出速度が得られると報告している[12]。しかし、高濃度の酸やアルカリ溶液にアスタキサンチンを置くと分解しやすいことは注目に値します。以上の結果から、haematococcus pluvialisという特殊な細胞壁構成のため、直接溶媒抽出が細胞内に入り込むことができず、補助的な超音波、マイクロ波、酸塩基処理はいずれもアスタキサンチンの分解を引き起こしやすく、アスタキサンチン抽出には適していないことが明らかになった。

1.2機械的細胞壁破壊+溶媒抽出

機械的細胞壁破壊は、外部からの力を利用してpluvialis haematococcusの細胞壁を破壊する、実験室で最も一般的に使用される方法である。検出のための国家基準で学名はhaematococcus pluvialisgb / t 31520-2015 [13], haematococcus pluvialisをガラス均質化剤を用いて徹底的に粉砕し、ジクロロメタン-メタノールを溶媒としてその色素を抽出する。アスタキサンチンの検出には、機械的破砕+溶媒抽出法がより一般的に使用されています[10,14-16]。機械破砕は細胞壁を損傷させ、色素を完全に抽出することができます。操作は簡単ですが、この方法では、各サンプルをセルホモゲナイザーで粉砕する必要があり、時間と労力がかかります。

1.3セルラーゼ壁破壊+溶媒抽出

ヘマトコッカス・プルビアリスの細胞壁は、主にセルロース、ペクチン、リポ多糖などの物質で構成されているため、ヘマトコッカス・プルビアリスの細胞壁を壊すために、セルラーゼ、ペクチナーゼ、多糖アーゼが使用されている[8]。zhou jinkeらは、haematococcus pluvialisからアスタキサンチンを抽出するための新しい酵素法を探索した〔17〕。セルラーゼ:藻類粉末の酵素加水分解、エタノール抽出。酵素抽出の最適条件は、酵素溶液の初期ph 4.5、酵素加水分解温度45°c、酵素投与量1.5%、酵素加水分解時間15時間で、アスタキサンチン抽出率は94.6%と、従来の直接エタノール抽出法よりも61.5%高い。これは、低動作温度、低汚染、低コスト、高い抽出速度の利点を持っています。グリーンな工業生産を実現することは容易ですが、この方法は時間がかかり、高温ではアスタキサンチンの分解を引き起こす可能性があります。

1.4 dmso抽出法

dmsoは、様々な溶媒との良好な混和性と細胞への良好な透過性を有しています。多くの場合、薬剤や農薬の浸透増強剤として、また細胞の凍結保存における保護剤として使用されます。seelyはdmsoを用いて微小なクロロフィルとカロテノイドを抽出できることを最初に報告した[18]。boussibaらは、haematococcus pluvialisから色素を抽出するためにdmsoを用いた。抽出も行う10分が70°C水浴」、と藻の残りカスでき无色抽出2 ~ 3回を繰り返すことで70°C水浴」の[19]ほどDMSOの心得て、よく作り通気性細胞がしみ込まのHaematococcuspluvialisが完全にアスタキサンチンを抽出したもようですdmso抽出は、赤血球の細胞壁の処理を必要とせず、アスタキサンチン抽出プロセスを大幅に簡素化し、アスタキサンチン検出に使用されている[20-21]。さらに、のworld&#このような日本のシアノテック、富士、中国など39の大手微細藻類企業、' sグリーンaバイオエンジニアリング会社[8]は、すべてのアスタキサンチン検出にhaematococcus pluvialisからアスタキサンチンを抽出するためのdmso法を適用しました。

dmsoを膨潤剤として使用すると細胞壁の透過性を高めることができ、haematococcus pluvialisからのアスタキサンチンの抽出剤として使用することができ、haematococcus pluvialisの検出に必要な細胞壁を破るプロセスを簡素化することができる。

2 .アスタキサンチンエステルの加水分解

のアスタキサンチンはhaematococcus pluvialisに蓄積される全トランスは3 s、3 s &ですか#39;配置,各エンドサイサイクリック構造に1つのヒドロキシ基を持つ。通常、c16、c18またはc20脂肪酸でエステル化され、構造を安定化させるためにアスタキサンチンエステルを形成する[22]。そのほとんどはアスタキサンチンmonoesters約75%を占め、アスタキサンチン二エステルは約20%を占め、遊離アスタキサンチンは5%しか占めない[12,23]。haematococcus pluvialisには30種類ものアスタキサンチン単エステルとジエステルが存在する[24]。アスタキサンチンエステルは複雑であるため、精製と直接的かつ正確な定量に問題があります。そのため、hplcによる正確な定量と単一物質の精製のためには、抽出されたアスタキサンチンエステルを遊離アスタキサンチンに加水分解する必要があります。一般的に、アスタキサンチンエステルの加水分解には、saponificationと酵素加水分解の2つの方法がある。

2.1ケン

サポニン化は、一般的にnaohまたはkohメタノール溶液中で行われるhydrolyzeアスタキサンチンesters空いて自由なアスタキサンチン。yuanらは、アルカリ濃度や反応温度が高くなるとアスタキサンチンの加水分解が促進されることを示した[14]。chen xingcaiらは、アルカリ濃度を上げると遊離アスタキサンチンの濃度が直線的に低下することも示した[25]。yuanらはエステルのsaponification下でのアスタキサンチンの加水分解速度と異なるアルカリ濃度下でのアスタキサンチンの分解を調べた。その結果、naoh濃度0.0175~0.020 mol・l-1の22°c反応系において、アスタキサンチンエステルは完全に加水分解され、分解は起こらなかった。しかし、高濃度の直メタノール溶液や反応温度が高いと、アスタキサンチンの分解が顕著になる[26]。アスタキサンチンエステルのsaponification法の条件は厳しいです。アルカリ溶液の濃度、腐化温度、腐化プロセス中の時間は、すべて腐化と効率に影響を与えます安定アスタキサンチン,これは、アスタキサンチンの正確な決定に影響を与える別の側面であります。

2.2酵素加水分解法

趙はペニシリウムシクロピウムの水溶性アルカリエステラーゼがアスタキサンチンエステルをアスタキサンチンに変換することを報告した。反応条件は28°c、攪拌7時間で、アスタキサンチンの回復率は63.2%に達した[27]。しかし、この酵素は加水分解効率が低く、アスタキサンチン含有量の測定には広く用いられていませんでした。jacobsは、脂質可溶性コレステリエステラーゼがカロテノイドエステルを急速に加水分解することを初めて報告した[28]。この酵素法に関する文献はほとんどありませんが、アスタキサンチンを製造する国内外の企業で、緩やかな加水分解法として利用されています。使用されたコレステラエステラーゼは、完全にアスタキサンチンエステルを加水分解するだけでなく、容易にアスタキサンチンの酸化を引き起こさないため、より正確にアスタキサンチン含有量を決定することができます。

コレステロールエステラーゼの使用アスタキサンチンを含むhaematococcus pluvialisエキス短時間で大幅にhaematococcus pluvialis中のアスタキサンチンの検出効率を向上させます。

3 . haematococcus pluvialisにおけるアスタキサンチンの定量的検出

アスタキサンチンを検出する主な方法は分光測光法、加水分解hplc、hplc-msである。

3.1観察し

boussibaは、haematococcus pluvialisのクロロフィルを5%のkoh-30%メタノール溶液で約10分間加熱して破壊し、その後、dmsoでアスタキサンチンを抽出した。吸光度は475 nmの波長で測定され、アスタキサンチン濃度が計算された。この方法は、アスタキサンチン含有量を迅速に推定することができ、栽培や生産に広く使用されています[12,29]。しかし、この方法でアルカリ溶液を処理してクロロフィルを破壊すると、アスタキサンチンが25 ~ 40%分解されるという報告もあります[16]。

そこで、li et al.はboussiba &を改良した#dmsoからアルカリ処理せずに直接抽出し、530 nmの可視光波長で検出することにより、他のカロテノイドやクロロフィルとの干渉を回避する39;s法。この方法は、haematococcus pluvialisにおけるアスタキサンチン含有量の迅速な検出に使用された[16]。金田一耕助Jinfeng'sの研究は、栽培プロセス中のhaematococcus pluvialisにおけるカロテノイドおよびアスタキサンチンの含有量が安定した線形関係にあることを示しています。カロテノイドを直接簡便に測定し、間接的にアスタキサンチン含有量を得る方法を用いることで、カロテノイド含有量を迅速に測定し、得られたカロテノイドとアスタキサンチンの相関関係から、haematococcus pluvialisのアスタキサンチン含有量を迅速に算出することができる。からデータをこのラボラトリーな前例を見てもは線形関係カロテノイドアスタキサンチンに测定を観察してコンテンツ酵素で測定されるhydrolysis-HPLCされている(図1)ため、DMSO抽出法を用いてアスタキサンチンを決定するコンテンツを分光法475 . nmで形を図1に関係を説明する図。

3.2 Hydrolysis-HPLC方法

haematococcus pluvialis色素をsaponificationまたは酵素加水分解によって前処理した後、hplcを使用して遊離アスタキサンチンを正確に決定することができる。現在、アスタキサンチン測定の国家規格gb / t 31520-2015は、hplc法をsaponificatイオンafter determinationに使用している[13]。分離カラムは逆相c30カラムであり、全経フリーのアスタキサンチン、9-cis-アスタキサンチン、13-cis-アスタキサンチンを20分で検出できる。グラジエント溶出の移動相としてメタノール/ジクロロメタン/アセトニトリル/水を用い,1試料を16分で検出した[30]。Cyanotech&#haematococcus pluvialisの含有量を決定するための39の方法は、色素を抽出し、hplcを決定するためにそれを加水分解することである。この前処理を加水分解することでアスタキサンチンエステルをアスタキサンチンに変換し、それを混合成分に変換して1つのアスタキサンチン成分を検出することで、hplc分析が簡易化され、正確な定量が可能となり、高い再現性が得られます。詳細を見るアスタキサンチン逆相クロマトグラフィー分離条件を表1にまとめました。

3.3 HPLC-MS方法

の多様性と複雑さのために抽出アスタキサンチンまた、そのエステル誘導体である従来の分光法やhplc法では、異なるアスタキサンチンエステル分子の違いを識別することはできません。質量分析法では、アスタキサンチンエステル分子間の質量や断片の情報の違いを利用して分子間の識別を行い、定性的・定量的な分析を行うことができます。hplc / msを用いずに抽出した色素試料を直接測定する方法は、腐生過程でのアスタキサンチンの劣化を防ぎ、アスタキサンチン、アスタキサンチンエステル、その他カロテノイド、クロロフィルを同時に測定することができます。

これは、アスタキサンチン組成の決定とアスタキサンチン代謝機構の研究に特定の用途を持っています。holtinらは、haematococcus pluvialisの遊離アスタキサンチン異性体、アスタキサンチンモノエステル、アスタキサンチン二エステル、およびルテインを定性的に分析するためにlc (apci) msを使用した[24]。weesepoelらはesi-itとmadil-tの/ tofを用いて、より詳細な分析を行ったアスタキサンチンestershaematococcus pluvialisで,の決定を含みますアシル鎖アスタキサンチンエステルそして、cisとtransの異性体の区別[32]。より多くのクロマトグラフィー分離アスタキサンチンとそのエステル誘導体表1にまとめてあります。カロテノイドやアスタキサンチンエステルは極性が低いため、一般的に使用される軟質イオン化esiイオン源を用いてカロテノイドをイオン化することは困難です。apciイオン源は、アスタキサンチンエステルの分析に一般的に使用されています。

本稿では,その抽出法,加水分解法,検出法について検討する学名はhaematococcus pluvialis。アスタキサンチン含有量はdmsoで抽出した後、波長475 nmの分光測光により直接測定される。分光光度計で測定したカロテノイド含有量とhplcで測定したアスタキサンチン含有量の線形関係に基づいて、アスタキサンチン含有量を迅速に計算します。この方法は、研究中に重要なパラメータを迅速に取得するのに役立ちます。dmso抽出後は、コレステロールエステルを加水分解し、hplcを用いて遊離アスタキサンチン含有量を決定することで、アスタキサンチン含有量を正確に決定する方法として利用できる。検出目的に応じて分析方法が異なり、抽出したサンプルを加水分解処理してhplc分析した結果を、異なるラボや方法間のデータ比較に修正する必要があります。

参考:

[1]小林正樹,坂本正樹。緑藻haematococcus pluvialis由来アスタキサンチンエステルの一重項酸素消光能[j]。バイオテクノロジー手紙、1999年、21(4):265-269。

[2] Naguib Y M a .抗酸化 活動 のアスタキサンチン と 関連 カロチノイド色素[J]。誌 農業 と 2000年食品化学48(4):1150-1154。

[3] higuera-ciapara i, felix-valenzuela l, goycoolea f m . astaxanthin: a review のits chemistry とapplications[j]。^「review でfood science とnutrition,2006」。food science and nutrition (2006) . pp . 185-196. 2014年3月18日閲覧。

[4] cuellar-bermudez s p、aguilar-hernandez i、cardenas-chavez d l、et al

微細藻類から:必須脂質、アスタキサンチンおよびフィコビリプロテイン[j]。微生物バイオテクノロジー、2015年8(2):190-209。

[5] lでw c, chien j t, chen b h.spear shrimp shells(parapenaeopsis hardwickii)中のカロテノイドの液体クロマトグラフィーによる測定[j]。農業・食品化学誌,2005,53(13):5144-5149。

[6] ni hui, hong qinglin, xiao anfeng, et al。ピヒア・パストリスからのアスタキサンチン高収量株の生産性能[j]。中国バイオ工学研究会,2011,27(7):1065-1075。

[7]金 D-Y、Vijayan D、Praveenkumar R, et アルCell-wall 混乱 质と脂质/アスタキサンチン 微細藻類からの抽出:クロレラおよびヘマトコッカス[j]。Bioresource技術を取り入れた2016」、「199:300-310です。

[8] yu shaolei, du weichun, yao qiao, et al。プロセス研究の壁を破るための物理的方法と組み合わせた酵素加水分解haematococcus pluvialis [j]。2016年(平成28年)4月1日-改築。

[9] zu yuangang, liu lina, xue yanhua, et al。負圧キャビテーション法によるアスタキサンチン抽出[j]。^北陸大学、2007年(平成19年)、59-60頁。

[10] mendes-pinto m m、raposo m f j、bowen jet al. haematococcus pluvialisの回状細胞に対する異なる細胞破壊過程の評価:アスタキサンチン回収への影響および生物学的利用能への影響[j]。journal のapplied phycology,2001,13(1):19-24。

[11] Ruen-ngam D、Shotipruk A Pavasant p比較 of  抽出 方法 ため 回復 of  アスタキサンチン Haematococcusからpluvialis [J]。^ a b c d e f g h i科学技術研究所、2011年、46(1):64-70。

[12] sarada r、vidhyavathi r、usha d、他。緑藻haematococcus pluvialisからのアスタキサンチン抽出の効率的な方法[j]。農業・食品化学誌,2006,54(20):7585-7588。

[13] GB / T 31520-2015haematococcus pluvialisにおけるアスタキサンチンの測定-液体クロマトグラフィー法[p]。2015年中国。

[14] yuan j p, chen f . haematococcus pluvialis抽出物からのトランス・アスタキサンチンのクロマトグラフィー分離精製[j]。農業・食品化学誌、1998年、46(8):3371-3375。

【15位】 sun weihong, xiao ronghui, leng kailiang, et al。haematococcus pluvialisにおけるアスタキサンチンの測定のためのc30逆相高性能液体クロマトグラフィー法[j]。^「journal of analytical testing, 2010, 29(8): 841-845」。journal of analytical testing(2010年). 2010年9月29日閲覧。

[16] [16]李Yミャオ族 F耕助 まだ アル正確な 量子化 のアスタキサンチン から Haematococcus  原油 抽出 spectrophoto-metrically [J]。2012年中国海洋紀要陸水学者、30(4):627-637。

[17] zhou jinke, li jinhua, ge fahuan, et al。haematococcus pluvialisからアスタキサンチンを抽出する新しい酵素法の研究[j]。^「chinese materia medica, 2008, 31(9): 1423-1425。

[18] seely g r, vidaver w e, duncan m j .ジメチルスルホキシドを用いた褐藻からの色素の分取および分析抽出[j]。1972年(昭和47年)海洋生物学12(2):184-188。

[19] Boussiba S Vonshak a .アスタキサンチン 蓄積 in  の グリーン 緑藻 Haematococcus  pluvialis [J]。植物 and   1991年細胞生理学、32(7):1077-1082。

[20] orosa m、franqueira d、cid a、et al. haematococcus pluvialisにおけるアスタキサンチン蓄積の分析と増強[j]。2005年Bioresource技術、96(3):373-378。

[21] boussiba s, bing w, yuan j p,et al.環境ストレスにさらされた緑色藻haeamtococcus pluvialisにおける色素プロファイルの変化[j]。バイオテクノロジー手紙、1999年、21(7):601-604。

[22] breithaupt de .エビ(pandalus borealis)および小藻類(haematococcus)におけるアスタキサンチンエステルの同定および定量 pluvialis) 液体 クロマトグラフ 大量 離イオン化法 使用 マイナス ion  大気 圧力化学イオン化[J]。農業・食品化学誌,2004,52(12):3870-3875。

[23] miao f p, lu d y, li y g,et al.液体クロマトグラフィーによるhaematococcus pluvialis中のアスタキサンチエステルの特性評価-

大気圧化学イオン化質量分析法[j]。2006年分析生化学352(2):176-181。

[24]大人Holtin K Kuehnle M, Rehbein J et  アル決定 of  アスタキサンチン and  アスタキサンチン esters in  the   lc-(apci) msによる微細藻類haematococcus pluvialisおよびnmr分光法による支配的なカロテノイド異性体の特徴付け[j]。analytical and bioanalytical chemistry,2009,395(6):1613-1622。

[25] 陳興才、黄偉光、欧陽秦。アスタキサンチンエステルのsaponificationおよびhaematococcus pluvialisからの遊離アスタキサンチンの精製と分離[j]。福州大学紀要(自然科学編),2005,33(2):264-268。

[26] yuan j p, chen f . kineticsofastaxanthinestersの加水分解とhaematococcus pluvialisのアスタキサンチンのsaponification中の安定性[j]。農業・食品化学誌,1999,47(1):31-35。

[27] zhao y, guan f, wang g,et al. haematococcus pluvialis藻類抽出物からのリパーゼ触媒によるエステルの加水分解によるアスタキサンチン調製[j]。journal of food science,2011,76(4): c643-c650。

[28] jacobs p b, leboeuf r d mccommas s a,et al.コレステルエステラーゼによるカロテノイドエステルの切断[j]。比較生化学と生理b生化学&1982年(昭和57年)分子生物学72(1):157-160。

[29] geng jinfeng, zhang huimin, yang jianqiang, et al。haematococcus pluvialis中のアスタキサンチン含有量を決定するための迅速な方法[j]。2016年(平成28年)3月12日:ダイヤ改正。

[30] yuan j p, chen f . hplc-photodiode array detectionによるhaematococcus lacustris中のアスタキサンチン異性体の同定[j]。バイオテクノロジー技術は、1997年、11 (7):455-459

[31] peng j, xiang w, tang q,et al. hplcによるhaematococcus pluvialisおよび他の緑藻類の変異体e1におけるアスタキサンチンおよびそのエステルのc30カラムを用いた比較解析[j]。中国の科学シリーズc-life sciences,2008,51(12):1108-1115。

[32] weesepoel y, vincken j-p, pop r m,et al. haematococcus pluvialis由来の複雑なアスタキサンチンエステル混合物のmaldi-tof / tof-msスペクトルの診断値を高めるためのツールとしてのsodiation [j]。2013年日刊脱離イオン化法、48(7):862-874。