4 haematococcus pluvialis astaxanthin検査法

アスタキサンチン, chemically named 3,3' -dihydroxy-beta、beta' -carotene-4、4'-ジオンは、ケトカロテノイドに属します。研究によると、アスタキサンチンは最強の天然抗酸化物質です[1-2]。アスタキサンチンは、抗酸化、抗放射線、抗老化、抗腫瘍、心血管疾患の予防・治療機能[2-3]を有しており、極めて高い経済的価値を有しています。健康食品、医薬品、飼料添加物、化粧品、機能性食品、食品添加物などの分野で使用されています[4]。

アスタキサンチンの主な原料はエビとカニの殻[3,5]、pluvialis haematococcus[4]、glutinis rhodotorula[6]である。その中で、haematococcus pluvialisはストレス条件下で乾燥重量の5%まで蓄積することができる。アスタキサンチンの構造は2つのキラルなc原子を含むため、haematococcus pluvialisの構造は3 s, 3 s &である#合成形態はキラル混合物で、主に3 r, 3 r &である#39である。haematococcus pluvialisは天然のアスタキサンチン生産の最良の供給源であると考えられている。

haematococcus pluvialisは、ストレス後にゼラチン状の殻のような外壁を形成する。細胞内の色素を抽出する際、従来の溶媒が細胞内部に入り込むことは困難であった。通常、細胞壁を破壊する方法を組み合わせる必要があります。第二に、haematococcus pluvialis細胞中のアスタキサンチンは、主にアスタキサンチンエステル、すなわちアスタキサンチンモノエステル分子および異なるアシル鎖を有するアスタキサンチン二エステル分子の形で存在する。hplc分析では、すべての分子のベースライン分離を達成することは困難であり、含量を計算する際に分子量が異なります。

また、アスタキサンチンは不安定であり、光や熱などの条件下で分解しやすいため、正確な測定には問題がありました。本論文では、haematococcus pluvialisからのアスタキサンチンの抽出、加水分解、検出に関する現在の研究状況を概観し、様々な目的のためにhaematococcus pluvialis中のアスタキサンチン含有量を迅速に測定するための適切な方法の選択に関する指導を提供する。

1 haematococcus pluvialisからのアスタキサンチンの抽出

アスタキサンチンの抽出は、その含有量を正確に決定するための基礎であり、またアスタキサンチン測定の不確かな側面の1つです。ストレス条件下では、haematococcus pluvialis細胞はアスタキサンチンを蓄積するが、細胞の成長と分裂は停止し、動かない胞子、すなわちゼラチン状の細胞を形成する。成熟したゼラチン状細胞は3層の厚さの硬い細胞壁を持ち、最外層は酢酸の加水分解に強いアルゲナンである。第2層と第3層は、それぞれマンノースとセルロースが均一かつ不均一に分布している[7]。

ゼラチン質の細胞壁を持つhaematococcus pluvialisの場合、従来の溶解・抽出法では細胞内部にアクセスして色素を抽出することができません。

At present, でのindustry, supercritical CO2 抽出technology [7], high pressure/ultra-high pressure homogenizatイオンextraction technology [8], とマイナスpressure cavitation method [9] are used to 抽出アスタキサンチンからHaematococcuspluvialis。 The above 方法can effectively 抽出astaxanthin, but they require a large amount のalgal powder とare complicated to operate, so they are suitable ためlarge-scale industrial production. The extraction methods used to detect 学名はhaematococcus pluvialis include solvent extraction, mechanical grinding + solvent extraction, dimethyl sulfoxide (DMSO) extraction, とcellulase wall breaking + solvent extraction.

1.1溶媒抽出法

溶媒抽出法は、操作が容易で低コストであり、設備も少ない。抽出溶媒、液対溶媒比、抽出温度、抽出時間を最適化するだけで済みます。一般的に使用される溶媒は、アセトン[10]、酢酸エチル、ジクロロメタン、エタノールなどです。しかし、haematococcus pluvialisのゼラチン状の殻の外壁のために、従来の溶媒が細胞内に入り込むことができず、アスタキサンチンの抽出率が低い。Mendes-Pintoら紙はアセトンからアスタキサンチン抽出溶媒に使わHaematococcuspluvialis、抽出率はわずか4 mg・てろ助け(アスタキサンチン大量藻は1 gにつき抽出粉)、机械が粉砕+アセトン抽出問題は19% mg・てろ助けを示す抽出する細胞に入れなかっに使う溶媒アスタキサンチン[10]。

Ruen-ngam compared solvent extraction methods assisted by ultrasound (Ultrasound Assisted Extraction), microwave (Microwave Assisted Extraction), とSoxhlet (Soxhlet Extraction). The extraction rate のアスタキサンチンreached 74% 使用microwave assisted extraction at 75 °C for 5 mで[11]. In addition, to enhance のextraction efficiency のthe solvent, chemical cell wall 混乱involves treating Haematococcus pluvialis cells with acids or alkalis. Sarada et al. reported that treating the cells with 2 mol·L-1 hydrochloric acid solution at 70 °C for 2 min, followed by extraction with a solvent, can achieve an アスタキサンチン抽出 rate の86%–94% [12]. However, it is worth noting that placing アスタキサンチンin a high concentration of acid or alkali solution can easily cause degradation of astaxanthin. The above results show that due to the special cell wall composition of Haematococcus pluvialis, direct solvent extraction cannot enter the cells, while auxiliary ultrasound, microwave and acid-base treatments are all prone to cause degradation のアスタキサンチンand are not suitable for アスタキサンチンextraction.

1.2機械的細胞壁破壊+溶媒抽出

機械的細胞壁破壊は、外部からの力を利用してpluvialis haematococcusの細胞壁を破壊する、実験室で最も一般的に使用される方法である。haematococcus pluvialis gb / t 31520-2015[13]におけるアスタキサンチン検出のための国家規格では、haematococcus pluvialisはガラスホモゲニザーを用いて徹底的に粉砕され、その色素はジクロロメタン-メタノールを溶媒として抽出されている。アスタキサンチンの検出には、機械的破砕+溶媒抽出法がより一般的に使用されています[10,14-16]。機械破砕は細胞壁を損傷させ、色素を完全に抽出することができます。操作は簡単ですが、この方法では、各サンプルをセルホモゲナイザーで粉砕する必要があり、時間と労力がかかります。

1.3セルラーゼ壁破壊+溶媒抽出

Since the cell wall of Haematococcus pluvialis is mainly composed of substances such as cellulose, pectin and lipopolysaccharides, cellulase, pectinase and polysaccharidase are used to break the cell wall of Haematococcus pluvialis [8]. Zhou Jinke et al. explored a new enzymatic method for extracting アスタキサンチンfrom Haematococcus pluvialis 〔17〕. Cellulase: enzymatic hydrolysis of algal powder, ethanol extraction. The optimal process conditions for enzymatic extraction are: initial pH of the enzymatic solution 4.5, enzymatic hydrolysis temperature 45 °C, enzyme dosage 1.5%, and enzymatic hydrolysis time 15 h. Under these conditions, the astaxanthin extraction rate was 94.6%, which is 61.5% higher than the traditional direct ethanol extraction method. It has the advantages of low operating temperature, less pollution, low cost, and high extraction rate. It is easy to achieve グリーンindustrial production, but this method is time-consuming, and high temperatures can also cause degradation of astaxanthin.

1.4 dmso抽出法

dmsoは、様々な溶媒との良好な混和性と細胞への良好な透過性を有しています。多くの場合、薬剤や農薬の浸透増強剤として、また細胞の凍結保存における保護剤として使用されます。seelyはdmsoを用いて微小なクロロフィルとカロテノイドを抽出できることを最初に報告した[18]。boussibaらは、haematococcus pluvialisから色素を抽出するためにdmsoを用いた。抽出も行う10分が70°C水浴」、と藻の残りカスでき无色抽出2 ~ 3回を繰り返すことで70°C水浴」の[19]ほどDMSOの心得て、よく作り通気性細胞がしみ込まのHaematococcus pluvialisが完全にアスタキサンチンを抽出したもようですdmso抽出は、赤血球の細胞壁の処理を必要とせず、アスタキサンチン抽出プロセスを大幅に簡素化し、アスタキサンチン検出に使用されている[20-21]。さらに、the world&#このような日本のシアノテック、富士、中国など39の大手微細藻類企業、' sグリーンaバイオエンジニアリング会社[8]は、すべてのアスタキサンチン検出にhaematococcus pluvialisからアスタキサンチンを抽出するためのdmso法を適用しました。

dmsoを膨潤剤として使用すると細胞壁の透過性を高めることができ、haematococcus pluvialisからのアスタキサンチンの抽出剤として使用することができ、haematococcus pluvialisの検出に必要な細胞壁を破るプロセスを簡素化することができる。

2 .アスタキサンチンエステルの加水分解

haematococcus pluvialisに蓄積されたアスタキサンチンは、すべてトランス3 sであります,3 s 'configuration, with one hydroxyl group in each endocyclic structure. It is usually esterified with C16, C18 or C20 fatty acids to form アスタキサンチンestersto stabilize its structure [22]. Most of them are astaxanthin monoesters, accounting for about 75%, astaxanthin diesters accounting for about 20%, and free astaxanthin only accounting for 5% [12, 23]. There are as many as 30 different types of astaxanthin monoesters and diesters in Haematococcus pluvialis [24]. The complexity of astaxanthin esters makes purification and direct and accurate 量子化problematic. Therefore, the extracted astaxanthin esters need to be hydrolyzed into free astaxanthin to achieve purification of a single substance and accurate quantification by HPLC. There are generally two methods for hydrolyzing astaxanthin esters: saponification and enzymatic hydrolysis.

2.1ケン

saponificationは一般的にnaohまたはkohメタノール溶液中で行われ、アスタキサンチンエステルを遊離アスタキサンチンに加水分解する。yuanらは、アルカリ濃度や反応温度が高くなるとアスタキサンチンの加水分解が促進されることを示した[14]。chen xingcaiらは、アルカリ濃度を上げると遊離アスタキサンチンの濃度が直線的に低下することも示した[25]。yuanらはエステルのsaponification下でのアスタキサンチンの加水分解速度と異なるアルカリ濃度下でのアスタキサンチンの分解を調べた。その結果、naoh濃度0.0175~0.020 mol・l-1の22°c反応系において、アスタキサンチンエステルは完全に加水分解され、分解は起こらなかった。しかし、高濃度の直メタノール溶液や反応温度が高いと、アスタキサンチンの分解が顕著になる[26]。アスタキサンチンエステルのsaponification法の条件は厳しいです。アルカリ溶液の濃度、腐化温度、腐化プロセス中の時間は、すべて腐化の効率とアスタキサンチンの安定性に影響し、アスタキサンチンの正確な測定に影響するもう一つの要素です。

2.2酵素加水分解法

Zhao reported that a water-soluble alkaline esterase from Penicilium cyclopium can convert astaxanthin esters into astaxanthin. The reaction conditions were incubation at 28 °C with stirring for 7 h, and the 回復of astaxanthin reached 63.2% [27]. However, this enzyme has low hydrolysis efficiency and has not been widely used in the determination of astaxanthin content. Jacobs first reported that the lipid-soluble cholesterol esterase can rapidly hydrolyze carotenoid esters [28]. Although there are currently few reports in the literature on this enzymatic method, it is used by domestic and foreign companies producing astaxanthin as a gentle method of hydrolysis. The cholesterol esterase used not only completely hydrolyzes the astaxanthin ester, but also does not easily cause oxidation of astaxanthin, which can more accurately determine the astaxanthin content.

短期間にアスタキサンチンを含有するhaematococcus pluvialisエキスにコレステロールエステラーゼを使用すると、haematococcus pluvialisの検出効率が大幅に向上します。

3 . haematococcus pluvialisにおけるアスタキサンチンの定量的検出

アスタキサンチンを検出する主な方法は分光測光法、加水分解hplc、hplc-msである。

3.1観察し

Boussiba reported that chlorophyll in Haematococcus pluvialis was destroyed by heating with 5% KOH-30% methanol solution for about 10 minutes, and then the astaxanthin was extracted with DMSO. The absorbance was measured at a wavelength of 475 nm to calculate the astaxanthin concentration. This method can quickly estimate the astaxanthin content and is widely used in cultivation and production [12, 29]. However, some reports have shown that the treatment of the alkali solution to destroy the chlorophyll in this method causes 25% to 40% degradation of astaxanthin [16].

そこで、li et al.はboussiba &を改良した#dmsoからアルカリ処理せずに直接抽出し、530 nmの可視光波長で検出することにより、他のカロテノイドやクロロフィルとの干渉を回避する39;s法。この方法は、haematococcus pluvialisにおけるアスタキサンチン含有量の迅速な検出に使用された[16]。金田一耕助Jinfeng'sの研究は、栽培プロセス中のhaematococcus pluvialisにおけるカロテノイドおよびアスタキサンチンの含有量が安定した線形関係にあることを示しています。カロテノイドを直接簡便に測定し、間接的にアスタキサンチン含有量を得る方法を用いることで、カロテノイド含有量を迅速に測定し、得られたカロテノイドとアスタキサンチンの相関関係から、haematococcus pluvialisのアスタキサンチン含有量を迅速に算出することができる。からデータをこのラボラトリーな前例を見てもは線形関係カロテノイドアスタキサンチンに测定を観察してコンテンツ酵素で測定されるhydrolysis-HPLCされている(図1)ため、DMSO抽出法を用いてアスタキサンチンを決定するコンテンツを分光法475 . nmで形を図1に関係を説明する図。

3.2 Hydrolysis-HPLC方法

After the Haematococcus pluvialis pigment is pretreated by saponification or enzymatic hydrolysis, HPLC can be used to accurately determine the free astaxanthin. At present, the national standard for astaxanthin determination GB/T 31520-2015 uses the method of HPLC after saponification for determination [13]. The separation column is a reverse-phase C30 column, and the detection of all-trans-free astaxanthin, 9-cis- astaxanthin, and 13-cis-astaxanthin can be detected in 20 min. Yuan used a C18 column to analyze astaxanthin esterified with saponin. Methanol/dichloromethane/acetonitrile/water was used as the mobile phase for gradient elution, and a single sample was detected in 16 min [30]. Cyanotech&#haematococcus pluvialisの含有量を決定するための39の方法は、色素を抽出し、hplcを決定するためにそれを加水分解することである。この前処理を加水分解することでアスタキサンチンエステルをアスタキサンチンに変換し、それを混合成分に変換して1つのアスタキサンチン成分を検出することで、hplc分析が簡易化され、正確な定量が可能となり、高い再現性が得られます。詳細を見るアスタキサンチン逆相クロマトグラフィー分離条件を表1にまとめました。

3.3 HPLC-MS方法

アスタキサンチンとそのエステル誘導体の抽出は多様で複雑であるため、従来の分光法やhplc法では、異なるアスタキサンチンエステル分子の違いを識別することができませんでした。質量分析法では、アスタキサンチンエステル分子間の質量や断片の情報の違いを利用して分子間の識別を行い、定性的・定量的な分析を行うことができます。hplc / msを用いずに抽出した色素試料を直接測定する方法は、腐生過程でのアスタキサンチンの劣化を防ぎ、アスタキサンチン、アスタキサンチンエステル、その他カロテノイド、クロロフィルを同時に測定することができます。

これは、アスタキサンチン組成の決定とアスタキサンチン代謝機構の研究に特定の用途を持っています。holtinらは、haematococcus pluvialisの遊離アスタキサンチン異性体、アスタキサンチンモノエステル、アスタキサンチン二エステル、およびルテインを定性的に分析するためにlc (apci) msを使用した[24]。weesepoelらは、esi-itとmadil-tof / tofを用いて、haematococcus pluvialisのアスタキサンチンエステルのアシル鎖の決定やcisとtransの異性体の区別など、アスタキサンチンエステルのより詳細な分析を行った[32]。アスタキサンチンとそのエステル誘導体のクロマトグラフィー的分離を表1に示す。カロテノイドやアスタキサンチンエステルは極性が低いため、一般的に使用される軟質イオン化esiイオン源を用いてカロテノイドをイオン化することは困難です。apciイオン源は、アスタキサンチンエステルの分析に一般的に使用されています。

本稿では,その抽出法,加水分解法,検出法について検討するastaxanthin in Haematococcus pluvialis。アスタキサンチン含有量はdmsoで抽出した後、波長475 nmの分光測光により直接測定される。分光光度計で測定したカロテノイド含有量とhplcで測定したアスタキサンチン含有量の線形関係に基づいて、アスタキサンチン含有量を迅速に計算します。この方法は、研究中に重要なパラメータを迅速に取得するのに役立ちます。dmso抽出後は、コレステロールエステルを加水分解し、hplcを用いて遊離アスタキサンチン含有量を決定することで、アスタキサンチン含有量を正確に決定する方法として利用できる。検出目的に応じて分析方法が異なり、抽出したサンプルを加水分解処理してhplc分析した結果を、異なるラボや方法間のデータ比較に修正する必要があります。

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