発酵によるcq10ユビキノールの生産方法

cq10は、ユビキノンとしても知られ、相対分子量863.4の脂溶性キノンであり、化学的には2&として知られる#39; 3-dimethoxy-5-methyl-6-decyloisopentenylbenzoquinone。コエンザムq10を室温で黄色または橙黄色の結晶性粉末である。coq10は室温で黄色または橙黄色の結晶性粉末で、融点は49℃で無臭、水に不溶である。構造式は以下の通りである。

1957年(昭和32鶴清めコエンザムq10 (CoQ10)には牛からmyocardiumその化学構造を測るとが喋ればコエンザムq10 (CoQ10)の活性として重要な役割を果たしている過程の空母哺乳类の呼吸器チェーンで、lipid-solubleとして電子キャリア呼吸器連鎖の中にあってセルラーenergy-generating要素としてれ、抗酸化セルラー代謝に巻き込まれて自然なことをしますそのため、coq10は、臨床・ヘルスケア、化粧品・スキンケアなど幅広い分野での応用が期待されており、ますます注目されています[1]。

現在、coq10の製造には、植物や動物の組織抽出、化学合成、微生物発酵の3つの方法がある。動物および植物組織抽出法は、主に動物の器官または一部の植物組織から製品を抽出することを指します。yuan yi[2]はこの方法を用いてブタの心臓からcoq10を抽出したが、新鮮なブタの心臓の収率はわずか75 mg/kgであり、原料源の制約から製品コストが高く高価であり、大規模生産に制限があった。

過酷な条件と多数のステップが化学合成法の特徴です。一方、微生物の発酵によるcoq10の生産は、経済性が高く、大規模生産が容易で、分離・精製が容易で、人体に吸収されやすい有望な方法です。

1. coq10を生産する微生物株

coq10の含有量は系統によって大きく異なりますが、rhodobacter sphaericusとrhodobacter sphaericusではcoq10の含有量が比較的多い微生物株を別表に示します。これらの光合成細菌はロドバクテリウム目に属し、ロドバクテリウム科(rhodobacteriaceae)とロドバクテリウム科(rhodobacteriaceae)に分類される。前者はrhodobacter sphaeroidesとrhodobacter sphaeroidesに分けられる。rhodobacter sphaeroidesおよびrhodobacter podocarpusはrhodobacteriaceae科に属し、rhodobacter sphaeroidesはcoq10の生産に理想的な株の1つである。

coq10株表[4]

2.菌株のミュータジェネシスとエンジニアリングバクテリアの構築

一般的に野生株は収量が低く、生産能力が工業化生産のニーズを満たしていないため、突然変異育種や遺伝子工学技術を用いて遺伝子改変する必要があります。

2.1系統の代謝調節のための育種

coq10の微生物合成経路は、芳香環の合成経路とイソプレノイド側鎖の生合成経路の2つに大別されます。そのため、芳香環とイソプレノイド側鎖の生合成経路に応じた代謝調節育種が可能である。

2.1.1栄養欠乏変異株の育種

代謝制御の原理によれば、coq10の分岐経路(例えば、coq10合成と前駆体を共有するチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンなどのベンゼン環を含む芳香族化合物の代謝合成経路)を弱めるか切断することで、coq10の産生量を増加させることができる[5]。liu keshan[6]は、agrobacterium tumefaciensを出発株として、ニトロソグアニジンとジエチル硫酸を用いた二重変異体処理によりチロシンとアスパラギン酸の二重欠陥を持つ変異体株をスクリーニングした。coq10変異株の生産量は91.28%増加した。

zhang yanjing[7]は添加物の収量への影響を研究する材料としてbulera pseu doalbaを使用した。その結果、大豆油、きな粉、トマトジュース、オレンジピールジュースは、coq10とカロテノイド合成の前駆体を多く含むため、coq10の生成を増加させることがわかった。タバコの葉とベータカロチンは、ベータカロチン合成の経路を遮断し、coq10合成の代謝流束を増加させ、coq10産生を増加させる。微生物におけるcoq10の合成は、カロテノイドの合成と密接に関連していることがわかります。したがって、カロテノイドの栄養不足株は、coq10の高収量株としてスクリーニングすることができます。

olsonとrundey[8]は、coq10の含有量を増加させるために、光合成細菌のカロテノイド欠乏株を開発した。吉田[9]は、ky-4113を赤血球細菌の出発株として用い、coq10の初期濃度は2.4mg/gの幹細胞であった。カロテノイド欠乏を示す高収量変異株cl-37、co-22、co-22-11をスクリーニングしたところ、開始株と比較してそれぞれ88%、150%、263%増加した。現在、日本では、変異株co-22-11を用いた発酵生産が行われており、その収量は770mg/ lの発酵出汁に達する[10]。

2.1.2代謝阻害抵抗性変異体の選択

coq10の含有量は、coq10の合成または関連する同化作用に対する代謝阻害剤のフィードバック効果を除去することによって増加させることもできる。coq10合成のフィードバック阻害に耐性のあるcoq10の構造類似体には、l-エチオニン(coq10合成の前駆体であるl-メチオニンの構造類似体)、ゾエリスロマイシン、ビタミンk3、およびcoq10または呼吸器系阻害剤の構造類似体であるいくつかの芳香族化合物がある[9]。

liu kesuan[6]は、アグロバクテリウム属tume-faciens agr1を用いた。1416年からとして、紫外线(Uv)、l-methyl-3-nitro-l-nitrosoguanidineとジエチル硫酸変異原、毒性の変異検诊を受ける株の一種チロシンがnutrient-deficientされグルタミン酸オキサロ酢酸、の構造analogsに対して抵抗、ビタミンK3やethylthionineなど鳥の巣をシンプルでかつ効果的・効率的方法の一種チロシンが突然変異を検出するグルタミン酸オキサロ酢酸、などの構造analogsビタミンK3やethylthionine。

変異体のたおれAGR0619やAGR0610に選ばれてを披露试写会がチロシンnutrient-deficientチビ构造的先の耐性ビタミンK3生成を抑えて侵さを防ぎ、簡単な、効果的かつ迅速ドローンプログラムモデル設計の序列株AGR0619とAGR0610と生産物をもってのユビキノールの29.14 0.0469 mg / L mg / L and 31.42 mg / L、リンコマイシン、それぞれl37.49%れポイントとl56.07%先発株を上回った。

吉田は、agrobacteriumtumefaciens ky-3085を起動菌として、ニトロソグアニジンを変異させ、エリスロマイシン、エチルチオニン、ビタミンk3などに耐性を持つ変異株au-55とm-37を得た。au-55を醗酵槽で58時間培養し、最大収率180 mg/ lであった。m-37は72時間培養した後、出発菌株として使用された。au-55の発酵時間は醗酵槽内で58 h,最大収率は180 mg/ lであった。発酵時間が短く、収量が高く、coq10の高濃度に対する耐性が高いau-55と比較して、m-37を72時間培養してこのレベルに達した。

アクチノマイシンd (actd)はテラトーゲンおよび発がん性物質であり、平面型フェノキサジン環と2つの環状ペンタペプチドを含み、dna分子に挿入して転写およびタンパク質合成を選択的に阻害する。そのため、actdは細胞毒性が強く、培地に一定量のactdを添加すると、細菌の細胞にストレスと毒性を与える。コエンザムq10 (COQ10)の活性は生理活性物質が生命体の免疫力を高め生物、もしするActD-resistant変異株変異原後、量はさらに重くなる可能性も細胞内生理活性物質が蓄積COQ10など、変異株。

pan chunmei[11]では、rhizobiumradiobacter wsh2601を開始株とし、アクチノマイシンd耐性株をスクリーニングモデルとし、紫外線とニトロソグアニジンによる変異誘発を組み合わせて高coq10産生株を得た。シェイクフラスコ実験によりcoq10株の収量を最適化し、最終的には34 mg/ lに達し、変異原化前の3.6倍に達した。

2.2遺伝子組換え細菌の構築

分子生物学的手法を用いて、coq10の生産に関わる重要な酵素遺伝子を遺伝子ベクターを介して大腸菌に導入し、コピー数を増やし、効率的にこれらの遺伝子を発現させることで、coq10の合成能力を高めます。これは、遺伝子工学を用いてcoq10生産のための発酵株を構築するための基本的なアプローチです。

微生物細胞におけるcoq10合成の速度制限段階は、ベンゾキノン環の前駆体であるp-ヒドロキシ安息香酸(phb)と側鎖構造であるポリイソプレンピロリン酸(ppp)との縮合反応である。この反応を触媒する酵素は、p-ヒドロキシ安息香酸ポリイソプレン二リン酸転移酵素である[12]。大腸菌では、この酵素はubia遺伝子にコードされており、長鎖ポリイソプレン二リン酸基質(ppp)に対して高い重合長特異性を必要としない。それは基質認識に対して比較的広い特異性を有する[13];側鎖ポリイソプレン二リン酸の形成は、ファルネシル二リン酸(fpp)とイソプレノイド二リン酸(ipp)の縮合を触媒するポリイソプレン二リン酸合成酵素によって決定され、ある程度の重合によってポリイソプレン二リン酸を形成し、それによって副酵素qの種類を決定する[14]。

大腸菌では、この酵素はispb遺伝子にコードされ[15]、最終的にcoq8を産生する。ispb遺伝子を不活化し、外来性のポリデコソプレンピロリン酸合成酵素遺伝子を導入すれば、大腸菌でcoq10生合成系を構築することが可能です。

zhang an[16]は、gluconobacter oxytocaからpcr増幅によってポリデシレンピロリン酸合成酵素遺伝子(ddsa)を得、酵素消化によって必要な断片を回収した。その結果、他のイソペンテニル二リン酸合成酵素遺伝子と相同(30%~50%)であることが判明し、発現ベクターにクローニングして融合ベクターを誘導し、対応するバンドがポリアクリルアミドゲル電気泳動(sds-page)上に現れた。

fan yi[17]は、gluconobacter oxytocaのポリ(deca-isopentene pyrophosphate)合成酵素遺伝子であるddsaを発現するための受容体として10種類の大腸菌を選択した。大腸菌確定された製品分析に表現できるポリ(deca-isoprene酸)活躍シンターゼそして、コエンザムq10を合成しも発见のつのうちの1つにddsA量表情大腸菌COQ8を上回りwild-type、活用の可能性について深くの兆しがありコエンザムq10 (COQ10)には大規模な発酵大腸菌で製造する。

したがって、適切な大腸菌受容体の選択は、今後の研究や工業生産にとって重要である。しかし、のユビキノールのなどコエンザイムプロダクションが参入製作の予定に伴うq .したがって、研究に注意酵素の特性のpolyisoprene酸シンターゼ他の関連する遺伝子の改造工事(例えば、にisPB遺伝子増強などubiA遺伝子の渋面を見て、など)、建設遺伝子工学で作られた細菌のユビキノールの生产を

3.coq10生産条件の最適化

coq10の発酵収率を向上させるために、代謝制御理論を適用して高収量変異株を選択したり、組換え株を構築したりすることに加えて、発酵条件の最適化もcoq10の発酵収率を向上させる効果的で便利な方法です。発酵条件の最適化は、発酵収量を向上させる効果的で便利な方法でもあり、主に培地の最適化、培養条件、必須物質の添加を含む。

liu ling[18]は、クリプトコッカスの黄色からcoq10を抽出し、窒素源、炭素源、初期ph値、発酵温度などの条件を分析した結果、最適な発酵条件が得られた。炭素ソーススクロースをそれぞれブドウ糖1.25g / Lとつぶ酵母のソースがある窒素,コーンシロップ0.3g / LずつpH、震度6.5温度28℃inoculum 5%の巻と中の巻の液体500ミリリットル小瓶krコミックス)、成長因子はタンパク質やタンパク質とタンパク質の成長要因inoculum量は5%だった。接種率は5%,500 mlバイアルの体積は50 ml,増殖因子はタンパク質の加水分解であった。発酵は28度、接種量は5%、500 mlの三角瓶の容量は50 ml、成長因子はタンパク質加水分解溶液である。

呉Zufang[19]としてRhizobiumですコエンザムq10 (COQ10)には、生産株の軽重によって効果をさまざまな要因た発酵やは、直交テスト上で行われた炭素ソース(ブドウ糖、ショ糖、曲輪)酵母餡、液体量装填され初期pH値との間で最終的仕込み条件を定め、:炭素源はグルコース1.5 g/100 mlとショ糖2.5 g/100 mlの混合物、酵母ペースト0.8 g/100 ml、初期ph 0.8 g/100 ml、炭素源はグルコース1.5 g/100 mlとショ糖2.5 g/100 ml、酵母ペースト0.8 g/100 mlであった。初期のペーハーのコンパウンドは? 7.0に巻く液体に500リットル火炎瓶の巻50 mL細菌の成長率は13.8。22.7%のユビキノールののg / Lと収益mg / L, 34%れた前にも53%より最適化がそれぞれ揺れの火炎瓶発酵環境です

袁京[20]は、coq10培地と光合成細菌r . capsulatusの培養条件を最適化し、酵母ペースト濃度3.13 g/ l、硫酸アンモニウム0.8 g/ l、mg2 +0.64 g/ l、fe2 +45 2mg/ l、mn2 +18mg/ l、co2 +16mg/ l、初期ph値7.0、温度30℃を得た。温度30℃。4 d培養後、coq10の細菌中の質量濃度は15.213 mg/ lから20.365 mg/ lに増加し、収量は約33.87%増加した。

wang genhua[21]は、rhizobium leguminosarumを研究対象とし、細胞の成長とcoq10合成に影響する培養条件を調べた。培養条件はph 5.0、温度30℃、接種量2%、25 mlの液体を含む500 mlの三角瓶、培養時間24時間であった。

liu ping[22]は、saccharomyces cerevisiaeの発酵条件を最適化し、最適な発酵条件は、15g/ lグルコース、15g/ lスクロース、10g/ lタンパク質、10g/ l酵母、10g/ l酵母ペースト、41.0g/ l mgso、41.0g/ l k2hpo、41.0g/ l kh2po、5.0 ph、50 ml接種、50 ml接種、250 mlバイアル瓶、24時間の培養時間であった。接種量は10%、インキュベーション温度は28℃~30℃、加振機速度は200r/min、インキュベーション時間は18時間であった。最適化されたcoq10収率は26.85mg/ lに達し、細胞バイオマスは27.56g/ lに達した。これに基づき、coq10に対する側鎖供給前駆体(カンナビノール)およびキノン供給前駆体(ヒドロキシ安息香酸およびcoq0)を調べ、コーンワインにおける分裂酵母の発酵に適した前駆体を同定した。 

酵母核分裂成長するための条件最適な発酵やトウモロコシからを原料とする日本酒の高い変换の前兆など、コエンザムq10が定めに、次のように28℃、200r / min ?孵化のbeb18h 0.5g / Lの発酵を続けるいくつさが加わりふ化beb18hの変換の前兆など、までの内収益率はのユビキノールのは33.1mg / L,それより91%の制御サンプル。

細胞内のcoq10産生では、2つの前駆体が一緒に添加されており、カンナビノール単独のものよりも低かったが、細胞外のcoq10産生では、前駆体の異なる添加はあまり効果がなかった。しかし、coq10の単位細胞当たりの収量から見ると、リコピンとcoq0を合わせた場合、coq10の単位細胞当たりの収量は1.35mg/gであり、ブランク制御より117%高い。

4.分離浄化

coq10は酸化しやすいため、分離・抽出過程でのcoq10の酸化的破壊を避ける必要がある。例えば、抗酸化物質であるピロガ酸はアルカリ性条件下で添加されるべきである。現在では、saponificatiにseparationとsolvent extraction separationの精製法が用いられている。

4.1アルコールとアルカリのsaponification抽出分離

調製した発酵菌は、丸底フラスコに、攪拌し、その後、水酸化ナトリウム-エタノール溶液の一定量を追加し、黒ペーストに細菌、この時間を攪拌し、還元抽出のためのn-アルカンを追加し、迅速に室温に冷却した。石油エーテルで数回抽出し、抽出物は水で洗浄して中性にし、次に無水硫酸ナトリウムで水を除去します。目的は、coq10と炭化水素溶媒をよりよく混和させ、後続処理を容易にすることです。

に集中小容量、クロマトグラフシリカゲルの吸着列、石油エーテル汤で洗って、不純物を取り除き、少量そして加え方法は? ether-petroleumエチルエーテル、法を獲得することは石器下のeluent减圧黄色は油が物質無水エタノール結晶と機オレンジの结合力を故人コエンザイムコエンザムq10 (COQ10)の活性[医疗机関リスト]の存在エタノールを生むのだとすれば、長期ケンmethoxyの移調の会にの指輪コエンザムq10 (COQ10)には、ethoxyグループのエタノールになったと推測物奴の背中にはうず巻きdi-ethoxy派生商品が検出された製品のユビキノールのできない形成、これらの不純物を防ぐため、許で代用すればNaOHとケン・メタノール[24]大人。

4.2アルカリ化抽出・分離法

丸底のフラスコに調製された発酵バクテリアは、一定量の水酸化ナトリウム、加熱逆流、急速冷却、石油エーテル、エーテルまたはエタン、および抽出のイソプロパノール混合物を加えます。その後、水洗浄、不純物を除去するための冷たい降水、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、coq10含有溶液の収集、その後、濃縮、無水エタノール結晶は、あなたがcoq10の結晶化を得ることができます[24-25]。

4.3乾燥または凍結乾燥した材料から炭化水素溶媒を抽出し、分離する

coq10は、石油エーテル、アルカン、n-ヘキサン、n-ヘプタンから直接抽出することができる。それでも、それを数回繰り返すか、または数時間揺らす必要があり、この方法は、溶媒が材料に容易に浸透するように、材料が完全に乾燥し、細かく粉砕されることを確実にしなければならない。凍結乾燥した材料を凍結すると、常温で開放系の水分を吸収して抽出効率に影響を与えるため、事前に石油エーテルなどの炭化水素系溶媒に0.5% ~ 1%のメタノールを添加する必要があり、その後の処理は上記と同様である。抽出後のsaponification法と比較すると抽出量は少ないが、coq10を破壊しないという利点がある[26-28]。

5. 分析 識別

5.1可視分光法

アルカリ性条件にしたがって、cyanoacetateエチル生み出しているコエンザムq10 (COQ10)の活性分子のmethoxyに代わるでき青いの原則サンプル少量のコエンザムq10 (COQ10)には、標準それぞれ無水エタノールを加えcyanoacetateエチル水酸化カリウム洗い出し液、揺れまあは青い反応を見てくださいで測定されるabsorbanceは620 nm、標準曲線が、コエンザムq10を企てると、隆房コンテンツのユビキノールのたサンプルはついにを算出する。最後に、試料中のcoq10の含有量を計算した[27]。

5.2紫外線 分光方法

coq10によると、275nmで安定した吸光度を持って、無水エタノールに溶解したcoq10標準サンプルを取り、275nmでその吸光度を測定し、coq10の標準曲線を作成し、その後、サンプルの吸光度によってcoq10の含有量を計算します。紫外線吸収曲線サンプルと标准的で曲線は一般に一致する、しかし、浄化のユビキノールのため、有機溶剤は繰り返し使用するうちがそびえなど一部の细胞は非常に不純物れて、の観察紫外線吸収曲線でサンプル275nm必ずそれなりに偏差何か小さいほつれ峰どのの決定は理解するためのユビキノールのこのように误差が持ってきます。この場合、薄肉クロマトグラフィーによって粗抽出物をさらに精製し、uv検出と組み合わせてcoq10の含有量を決定することができます[28]。

5.3高性能液体クロマトグラフィー(hplc)分析と測定

さらに試料の粗抽出物を薄層クロマトグラフィーで精製し、高性能液体クロマトグラフィー(hplc)で分析し、精製効果を明らかにした[29]。今回のhplc分析では不純物が少なく、coq10の決定に影響しないことが確認された。さらに結果を確認するために、検出波長を変えて別の波長のhplcを用いて基準と試料を分析することもできます。同时に、原則に沿う形で現在吸収ピーク縮小ない状態のユビキノールの、一定の水素化ホウ素ナトリウムに追加することができるサンプル実験されと吸収ピーク検出されたさっきがなくなると確認をさらに防止することができることはコエンザムq10 (COQ10)には、[28]コンテンツのユビキノールのを得ることができるの面積の算出吸収もっとも高い値となりました。

6.展望

現在、国際市場のユビキノールの価格は高い方だが、中国20t以上コエンザムq10 (COQ10)には、毎年大半は輸入に頼って、と大きな差を見せるものと国内市場では、主に孤立が低いと浄化収益率株の最低水準に下がっ発酵ユニット。高収量株を得るためには突然変異育種研究を大量に行う必要があり、遺伝子突然変異や突然変異を利用して探索速度を速めること、生合成を促進するための前駆体を追加してcoq10の含有量を高めることなどが求められる。

近年、coq10を生産する系統の構築が中国政府によって広く認められている。近年、coq10を生産する組換え系統の構築が一定の成果を上げていますが、coq10の合成経路が複雑であるため、参加遺伝子が多く散在しており、大規模な工業生産を実現するためにはさらなる研究が必要です。結論からいうと、産業生産のユビキノールのを実現させるいろいろな面から起動する必要がある場合が、探査などIn vivo生経路に対し、収量性の選択、繁殖優れる製造できます発酵の最適化条件の前兆biosynthesis-promoting物質研究隔世の最適化斎戒し、などがある。

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