アリュロース粉末は何から作られていますか?

DAllulose (D-psicoseor D-allulose) is a monosaccharide that occurs naturally in very small quantities. It is soluble in water, methanol とethanol, but not in acetone. Its melting point is 109 °C. D  アルロースはdのジアステレオ異性体である 自然界では、イチジク、サトウキビの糖蜜、ドライフルーツ、砂糖製品、小麦、植物などに少量含まれています。

dアロロースは、ゼロカロリー、血糖調節、抗酸化など、人体に有益な特性を持っています。甘味はスクロース(70%)に近く、大規模応用の可能性が最も高いスクロース代替品と考えられています[1]。Dに比べ 果糖およびD ブドウ糖、D 食物の抗酸化状態を長期間維持し、食品の風味、色、食感を保存することができます[2-4]。

In addition, it also has a significant effect on plants. Researchers at Kagawa University in Japan found that D-allulosecan induce crops such as rice にdefend against pests とregulate plant growth [1]. In 2011, のUS Food and Drug Administration (FDA) determined that D-allulose is generally recognized as safe (GRAS) ためfood. D-allulose can be used as a sweetener or as a component のfood additives, and has broad application prospects in the fields of diet, health care medicine and agriculture. As a new type of functional sweetener, its huge commercial value and marketprospects are waiting to be developed. This paper reviews the research progress of the physicochemical properties, synthetic process and genetic engineering modification of D-allulose, and discusses the development prospects of D-allulose with D-allulose 3-epimeraseas the object to predict the development prospects of D-allulose and provide a theoretical reference ためfuture research trends.

1 d allulose合成戦略

D  The chemical synthesis of allulose mainly uses glucose as the raw material, molybdate as the catalyst, and goes through chemical catalysis, chromatographic separation and purification, concentration and crystallization to prepare crystalline D  allulose[5]。bilikら[6]は、dの生成を触媒した allulose Dから 酸性溶液にモリブデン酸イオンを加えることによるフルクトース。しかし、得られた混合物には0.5%のdしか含まれていなかった allulose  わずか0.5%であり、混合物には、d-ソルビトール4.5%、d-タガトース1.0%などが含まれていました。収率が低く、副生成物が多く、その後の分離精製に役立たない。mcdonald[7]は、3段階の化学的方法を用いて、1,2:4,5-ジ- o-イソプロピリデンβ- d-フルクトフラノースの酸化と還元を変換し、dを生成した allulose。

Doner [8] boiled D fructose in a mixture of ethanol and triethylamine to prepare D allulose. Almost all chemical methods for preparing D  アリュロースには、収率の低さ、面倒な後続分離作業、重金属や酸性排水の汚染の容易さ、多くの副生成物などの問題があります。化学合成に比べて、環境にやさしい生物学的手法は、新たな研究ホットスポットとなっている。生物学的合成法d alluloseはD 基質としてのフルクトースとdを触媒するプシコース3 (dpe酵素)またはd dの上では、dをプシコース3 (psicose 3)にすることができます  フルクトースはジアステレオ異性化反応によって生じる。製品システムにはdフルクトースが多く含まれているため、最終製品を得るためには製品をイオン交換樹脂で分離・精製する必要があります。化学的な方法に比べて、dオールロースの生物学的合成はコストが安い上、安全で環境にやさしいうえ、汚染の可能性も低いため、今後の発展が期待される。

^ a b c dアニメ第2作

2. 1主要酵素のスクリーニング

1993年、和森ら[9]は、ケトースのc3位をエピメラーゼ化できるpseudomonas cichorii st 24からd-アルロース3-エピメラーゼを初めて報告した。この酵素は、d-タガトースに最も特異的であることから、dte酵素と命名された[10]。agrobacterium tumefaciensのdpe酵素は、d-フルクトース(700 g/ l)を特異的に触媒してd-アルロース(230 g/ l)を得ることができ、その変換率は32.9%である[11 12]。土壌由来のリゾビウム(sinorhizobium sp.)はトルエン処理後に透過性となり、最適な条件下で700 g/ ldのフルクトース(3.9 mol/ l)を触媒して37 g/ ldのアルドン酸を生成する[13]。

姜Bo's team at Jiangnan University is committed to screening for new D  allulose industrial strains. They screened a strain からa fish pond water sample with a high D  alluloseはrhodobacter sphaeroidesとして同定され、rhodobacter sphaeroides sk011と命名された。この株は、d-フルクトース(36 g/ l)を基質とすると6.54%の収率でd-アルロースを生産できる。この研究から、rhodobacter sphaeroides sk011が産生するdte酵素は、c3位のd-フルクトースのジアステレオ異性化を起こし、d- alluloseを産生すると推測されている。これは、d-フルクトースをd-アルロースに生変換する能力を持つ菌株が、中国で初めて報告された[14]。近年、国内外の研究者が相次いで異なる系統のdte酵素とdpe酵素を発見し、今後の研究のための強固な研究基盤を築いた。具体的な状況を表1にまとめた。

表1からわかるように、dorea sp.のdpeは6.0、r . sphaeroidesは9.0、その他のdpeとdteの最大酵素活性に対応するphは7.0~8.0である。r . sphaeroidesのdteの最大酵素活性に対応する温度は40℃であり、t . primita&のdpeの最大酵素活性に対応する温度は40℃である#39;s dpeとdorea sp.'s dpeの最大酵素活性は70°cの温度に対応し、他のdpeとdteの最大酵素活性に対応する温度はこの2つの温度の間にあります。ほとんどのdpeは、co2 +の存在下で高い酵素活性を示す。60℃でのc . cellulolyticumのdpe酵素の半減期は408分であり、これはdpeおよびdteで報告されている最高の熱安定性である。f . plautiiのdpe酵素は、ph 7.0および65°cで60分間750 g/ l dのフルクトースを触媒し、変換率32%で239 g/ l dのアルロースを生成する。desmospora sp.とdorea sp.のdpeは、dフルクトースとd alluloseの変換率が最も高い。さらに、d-フルクトースとd- alluloseのd-フルクトースとd- alluloseの反応は可逆的である。興味深いことに、ほとんどのdpeはd-フルクトースからd-フルクトースを生産する際に、d-フルクトースからd-フルクトースを生産する場合の2 ~ 3倍の効率でd-フルクトースを生産する(c . scindens dpeはd-フルクトースを触媒する7。これは、酵素がdの触媒作用をより促進することを示している allulose。現在、dの工業生産を推進しています アリュロースは依然として科学者にとって困難でホットなテーマであり、工業生産に適した効率的な触媒酵素のスクリーニングがボトルネックとなっている。

2.2酵素/セル煤油炉

酵素/細胞触媒技術は、食品バイオテクノロジーの分野で非常に重要です。ワイン製造・チーズ製造から酪農業、ベーキング産業、食肉加工、でんぷん・砂糖産業、石油産業、食品安全試験、飲料・ジュース産業などの幅広い工程に携わっています。ほとんどの酵素は、化学反応の活性化エネルギーを低下させるか基質を活性化させることによって化学平衡に影響を与えずに反応過程を大幅に加速させることができ、それによって反応速度を大幅に増加させることができる。

These advantages are very consistent with the development thinking of the food industry, and enzyme/cell catalysis technology has also become the mainstream technology for the industrial 生産of D-allulose。bai weiら[26]は、clostridium cellulolyticum h10からdpe遺伝子をクローンアップし、b . subtilisで発現・精製した。最適な条件の下で、2.5μgの制作に取り组むあっ浄化もよい酵素解媒D-allulose D-fructoseャ潟e[ションの500μL (10 g / L) D-allulose生産と27.3%の換算率。

The DPE enzyme からA. tumefaciens (AtDPE) has poor thermal stability. After being modified によってprotein engineering technology, the DPE enzyme can catalyze the production of 178 g/L D-allulose from 700 g/L D-fructose under optimal reaction conditions, with a conversion rate of 25%; while the wild-type AtDPE enzyme can only produce 107 g/ L D  allulose[27】。全細胞を用いてdの生成を触媒する allulose Dから フルクトースは酵素触媒よりも便利である。a . tumefaciensの二重変異体i33l / s213cのdpe遺伝子は大腸菌で発現した。4 g/ lの細菌が700 g/ lのd-フルクトースを触媒し、230 g/ lのd-アルロースを生成する。しかし、粗酵素抽出物を用いた反応では、わずか182 g/ lのdしか得られなかった  換算率は26%[28]である。さらに、c . cellulolyticumのdpe遺伝子を大腸菌で発現させた後、培養液で750 g/ l d-フルクトースを直接触媒して218 g/ l d-アルロースを得ることができ、変換率は29%に達した[17]。clostridium bolteaeのdpe遺伝子を大腸菌で発現させた後、2 gのc . bolteae細胞乾燥粉末が750 g/ ldのフルクトースを216 g/ ldのアルドン酸に変換する触媒を行い、変換率は28.8%であった[16]。

2. 固定化3技術

固定化酵素/細胞は遊離酵素に比べて酵素の安定性をさらに高め、酵素の寿命を延ばすことができ、遊離酵素には比べものにならない製品の分離や再利用などの利点がある。そのため、d- alluloseの工業生産には固定化酵素や固定化細胞技術が用いられることが多い。[29]pseudomonas sp. st 24の培養液からdte (psdte)を抽出し、bcw 2503担体上で酵素を固定化した。

d-フルクトースを添加した後、48時間の反応で約20%のフルクトースがd-アルロースに変換された。さらに最適化した後、キトパルビーズbcw 2510固定化psdteは、40°cで60 dを反応させた後、25%のd-フルクトースをd-アルロースに変換することができる[30]。agrobacterium tumefaciensのdpe (atdpe)触媒プロセスでは、反応系にホウ酸を添加することで、触媒プロセス全体の変換効率を効果的に向上させることができます。これは、ホウ酸のd-アルロースへの結合能が、ホウ酸のd-フルクトースへの結合能よりも強いためである。可逆反応では、ホウ酸がd-アルロースに結合すると、系内のd-アルロース濃度が低下する。反応系全体のバランスを保つために、より多くの基質(d-フルクトース)が反応の進行方向(d-アルロース)に移動する。濃度が低下する。反応系全体のバランスを保つために、より多くの基質(dフルクトース)が反応の進行方向(d allulose)に移動する。

しかし、添加できるホウ酸の量には限界があります。ホウ酸のモル比が0.6に達すると、d- alluloseの産生量が最大になる。モル比が0.6を超えると、d- alluloseの生産量は減少する傾向にある[31]。Duoliteがキャリア固定化として用いられる珠A568があるためD-allulose収益(441 g / L)換算率の反応(63%)にスナイパーAtDPE、ほう酸は2、3倍ものにも関わらず、すべてホウ酸でスナイパーAtDPE山よりも高い生产のリード強度は1.3倍多いずにスナイパー酵素と硼酸団子(32)。3回も[32]。

また、thermus thermophilusとatdpe変異体のグルコーイソメラーゼgi (ile33leu / ser213cys)をsaccharomyces cerevisiaeの胞子の細胞壁に同時に固定したところ、グルコースのd- alluloseへの変換を触媒する変換率は12%であった[33]。ruminococcus sp.のdpe遺伝子は、bacillus pumilusでクローン・発現された。アニオン交換樹脂上でdpe酵素溶液を精製固定化した後、固定化酵素は10回繰り返し使用しても酵素活性の約70%を保持し、触媒反応の変換率は26%に達した。元の細菌が作るdpeに比べて、dpe酵素は、元の細菌が作るdpeに比べて、タンパク質の溶解性、生物活性、発現や分泌が大幅に向上している[34]。

3遺伝子工学 

3.1酵素構造

このdpe酵素の工業的生産を実現するために、分子生物学的手法を用いてdpe酵素を遺伝子操作し、工業的応用の可能性を見出しました。atdpeのタンパク質結晶構造をx線回折技術を用いて解析し、dpeの触媒機構をさらに解明しました。分子モデル解析により、atdpeは図2(a)[35]に示すように、4つのサブユニットa、b、c、dからなる四量体プロテアーゼであることが明らかになった。各サブユニット8个β构成-folds 12α-helices、に関係しβ-foldsしっかりと囲まれ12α-helices、図2に示すように(b)[35]。この酵素は金属イオン依存性の酵素である。glu150、asp183、his209、glu244は金属イオンと結合し、atdpeの活性中心を形成する。trp112、glu156、arg215は酵素基質結合のための重要な部位である[36]。p . cichorii dte (pcdte)の立体構造から、pcdteはatdpeと類似した触媒部位と空間構造を持ち、図3に示すように、mol a、mol b、mol c、mol dの4つのサブユニットから構成されていることがわかりました[21]。

choiら[36]は、エラーを起こしやすいpcr法を用いてatdpeをランダムに変異させ、ser213cysとile33leuという安定性の高い2つの変異株をスクリーニングした。また、ile33leu / ser213cysの二重変異体(265分)の半減期は、atdpe、ser213cys、ile33leuのそれぞれ26倍、9倍、4倍であり、二重変異体の熱安定性は、重ね合わせ変異によって相乗的に向上することが示されました。choiら[36]は、分子シミュレーション解析により、変異株の熱安定性の変化は水素結合の増加とスタッキングによるものではないかと考えた。zhangら[37]は、円形二色性および蛍光クロマトグラフィーを用いて、dpeの貯蔵安定性に対するさまざまな添加物の効果を研究した。結果、α-helix密接に関连している構造はあっ構造安全性のもよい。いくつかの添加物(硫酸マンガンなど、果糖、有機リン)を守ることにつながるαあっ-helix構造もよい酵素ascorbic酸は破壊影響もα-helix構造です

近年、多くのdpe / dteの結晶構造はよく理解されていますが、その触媒機構はまだ明確に定義されていません。触媒作用や基質への結合における特定のアミノ酸部位の役割を決定するために、これらのアミノ酸残基を特定の種類のアミノ酸に置き換え、その特性を測定するために、部位指向突然変異法が用いられます。これは基質特異性と酵素触媒作用を理解するための基礎である。あっアミノ酸のシーケンスに対して比較分析もよい(AsDPE) Agrobacterium spたATCC31749やAtDPE AsDPEはとAtDPEは98%似た者同士(6アミノ酸が異なるのみ)の物理的な運動AtDPE (89 U / 9900 mg) 10%に止まっているAsDPE(志願者のU / mg)行事たった10%だって

これら6つの部位が酵素活性に与える影響をさらに検証するため、atdpeの界面相互作用を模倣した部位特異的変異株を作製した。その結果、野生型asdpeの酵素活性が25.5%しかない変異株asn234aspを除き、各サブユニットの表面にある残り5残基の酵素活性は、asdpeの酵素活性が15%しか低下しないことがわかりました。これは、位置234のasnが重要なインターフェース残基であることを示している。この部位がaspに変異すると、酵素活性は74.5%低下する。その理由は、変異後に四量体界面の水素結合ネットワークが変化し、酵素が弱まるためと考えられます(図4)#39;のd-フルクトースに結合する能力[38]。

3.2分子生物学的修飾

Romero etアル[39]found that the dual-enzyme coupling expression system has many advantages. When the two enzymes are close to each other, the first enzyme can create a favorable microenvironment for the second enzyme to react, so that the second enzyme has sufficient substrate, reducing the diffusion time of the substrate relative to the enzyme, and can more efficiently promote the reaction. Men et アル[40]cloned the D-glucose isomerase (GI) gene from Bacillus sp. bacillus (Bacillus sp.) D glucose isomerase (glucose isomerase, GI) gene and rumen microorganism (Ruminococcus sp.) DPE gene were co-transformed into the E. coli BL21 strain to construct a D allo-keto acid one-step catalytic system, which can catalyze the conversion of glucose to D allo-keto acid up to 16 %. Similarly, the coupling of GI from Acidothermus cellulolyticus and DPE from Dorea sp. CAG 317 forms a co-expression system that can catalyze the production of 89.1 g/L D-allulose from 500 g/L D-glucose [41].

4. d-alluloseの分離と精製

^ a b c d制作 基質の酵素反応によって得られるアルロースは、dを分離するためにさらに分離する必要がある フルクトースdおよび他の糖からのalluloseは高純度dを得る allulose。dについての知識不足のため 測定方法のalluloseと制限、具体的な内容d allulose in food is rarely reported. For many years, the separation of D-allulose from D-fructose has been a problem. Because the two have similar physical and chemical properties, such as molecular weight, molecular size and charge, it is difficult to completely separate D-fructose and D-allulose using common separation methods.

シミュレートムービングベッド(smb)技術は、クロマトグラフィー分離の原理に基づいた分離方法です。

固定相としてイオン交換樹脂を使用しています。運転コストが低く、操作が簡単で、分離効果が良いため、大規模連続生産に適しており、現在、砂糖製品の分離に広く使用されている[42]。nguyenら[43]は、静止相としてdowex 50 wx4 ca2 +イオン交換樹脂を用い、smbプロセスをシミュレーションした。 process, and finally found that: the purity and yield of allulose were 99. 04% and 97. 46%, respectively, while the purity and yield of the raffinate (D fructose) were 99. 06% and 99. 53%, respectively.

最適な運転条件の下で完全分離を達成しました(抽出純度99。36%ラフィネート純度9 9967%)。シミュレーション結果と実験結果は一致度が高く良好な分離結果を示し、効率的な分離手法としてsmbが実際のd- allulose生成に利用可能であることを示した。wagnerらは、smbを用いて連続クロマトグラフィーにおける多段階酵素カスケードの動作を実現できることを示した[44]。トランスグルコシダーゼ、d-キシロースイソメラーゼ、dteを用いることで、d-アルロースはd-グルコースとd- d-グルコースの中間体を介して効率的に生産される フルクトース、効率的に生産d アリュロース:精製して分離し、最終的に99の純度を得ることができる。収率は89%

liらは[45]アニオン交換樹脂を用いて、d-フルクトースをd-アルロースから容易に分離できるグルコン酸に変換した。システム全体は、それぞれ固定化グルコースイソメラーゼ(gi)と固定化グルコースオキシダーゼ(god)を含む2つの連続撹拌反応器(cstrs)から構成されている。この反応は、まず固定化giの触媒作用によってd-フルクトースをd-グルコースに変換し、次に固定化神の触媒作用によってグルコン酸に変換する。

最後に、グルコン酸はアニオン交換樹脂d309によって吸着され、リサイクルされます。最終結果によると、この製品はsmbで非常に希釈されており、結晶化する前に多くの濃度を必要とする。しかし、この酵素による精製後のd-アルロースの濃度は非常に高く、作業時間を大幅に節約でき、工業用途に非常に適しています。smbに使用される吸着剤マトリックスは比較的高価であるが、本システムで使用されるgi酵素やgod酵素の固定化に使用される材料やアニオン交換樹脂は一般的で安価であるため、プロセスの運用やスケールアップが容易である。最終的に、d- alluloseの精製率は91.2%に達し、d-フルクトースの大部分が除去され、精製されたd- alluloseはさらに>99%の純度にまで結晶化された。

5まとめと展望

In recent years, D-allulose has been recognized as an ideal substitute for sucrose。スクロースのような甘さがあるだけでなく、無カロリー、無毒性で加工しやすい。それは間違いなく優れた市場の見通しと商業的価値を持つ理想的な新しい甘味料です。しかし、現在では、d alluloseは、e . coliのエンドトキシンの影響を受けているため、食品安全性の面では隠された危険性があるため、工業的に大量に生産することはできない。一方、食品グレードのdpeおよびdte酵素発現宿主の開発・研究は比較的少ない。したがって、研究の次の段階では、食品グレードの微生物(例えば、saccharomyces cerevisiae、bacillus glutamicum、bacillus subtilisなど)を発現宿主として、工業生産のための株の欠陥を解決することができる。あっ②現在のすべてのもよいと胃のDTE酵素など問題を研究酵素活動性が低くと貧しいの安定だ。

酵素構造の特定の理解に基づいて、対応する突然変異や修飾を標的タンパク質に行うことができます。高い酵素活性を持つ株を開発することは、依然として長く困難な課題です。③生产税额の多くの研究のD-allulose D-fructoseを基板上として使う。しかし、フルクトースに比べてフルクトース-グルコースシロップの方が安価であり、酵素触媒を用いてd- alluloseを製造することができるため、d- alluloseの工業生産コストを下げることができる。④D alluloseはとても难しいから結晶化するのに、むしろ浄化は最終に役立つ分離反応の解決策から大幅に膨らむだろう難易度の生産プロセスを経営複雑です現在、dを引き起こす可能性のある方法を開発する必要があります alluloseは結晶化し、製品をよりよく分離することができ、後続の回収を助長し、分離と精製の運用コストを削減する。研究の進展に伴い、d-アロロースの工業生産に適した、高効率で低コストな生産方法の開発は、最終的には国民の利益となる。

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